খবর

Nature.com পরিদর্শন করার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ.আপনি যে ব্রাউজার সংস্করণটি ব্যবহার করছেন তাতে সীমিত CSS সমর্থন রয়েছে৷সেরা অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি আপডেট করা ব্রাউজার ব্যবহার করার পরামর্শ দিই (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে সামঞ্জস্য মোড অক্ষম করুন)৷ইতিমধ্যে, অব্যাহত সমর্থন নিশ্চিত করতে, আমরা স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়াই সাইটটিকে রেন্ডার করব।
ক্যান্সার কোষগুলি সেলুলার স্ট্রেস কাটিয়ে উঠতে এবং অগ্রগতি চালিয়ে যাওয়ার জন্য বিভিন্ন প্রক্রিয়া বিকশিত করেছে।প্রোটিন কিনেস আর (PKR) এবং এর প্রোটিন অ্যাক্টিভেটর (PACT) হল প্রাথমিক প্রতিক্রিয়াকারী যারা বিভিন্ন স্ট্রেস সংকেত নিরীক্ষণ করে যা কোষের বিস্তার এবং অ্যাপোপটোসিসকে বাধা দেয়।যাইহোক, ক্যান্সার কোষে PACT-PKR পথের নিয়ন্ত্রণ অনেকাংশে অজানা থেকে যায়।এখানে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে দীর্ঘ নন-কোডিং RNA (lncRNA) aspartyl tRNA সিনথেটেজ অ্যান্টিসেন্স RNA 1 (DARS-AS1) সরাসরি PACT-PKR পথের বাধার সাথে জড়িত এবং ক্যান্সার কোষের বিস্তারকে প্রচার করে।CRISPRi 971 ক্যান্সার-সম্পর্কিত lncRNA এর বড় আকারের কার্যকরী স্ক্রীনিং ব্যবহার করে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে DARS-AS1 উল্লেখযোগ্যভাবে বর্ধিত ক্যান্সার কোষের বিস্তারের সাথে যুক্ত ছিল।অতএব, DARS-AS1 নকআউট কোষের বিস্তারকে বাধা দেয় এবং ভিট্রোতে বিভিন্ন ক্যান্সার সেল লাইনে ক্যান্সার সেল অ্যাপোপটোসিসকে প্রচার করে এবং ভিভোতে টিউমার বৃদ্ধি উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করে।যান্ত্রিকভাবে, DARS-AS1 PACT অ্যাক্টিভেশন ডোমেনের সাথে সরাসরি আবদ্ধ হয় এবং PACT-PKR মিথস্ক্রিয়াকে বাধা দেয়, যার ফলে PKR অ্যাক্টিভেশন, eIF2α ফসফোরিলেশন হ্রাস করে এবং অ্যাপোপটোটিক কোষের মৃত্যুকে বাধা দেয়।চিকিৎসাগতভাবে, DARS-AS1 একাধিক ক্যান্সারে ব্যাপকভাবে প্রকাশ করা হয়, এবং এই lncRNA-এর অতিরিক্ত এক্সপ্রেশন একটি দুর্বল পূর্বাভাসের নির্দেশক।এই গবেষণাটি DARS-AS1 lncRNA দ্বারা PACT-PKR পথের ক্যান্সার-নির্দিষ্ট নিয়ন্ত্রণকে ব্যাখ্যা করে এবং ক্যান্সারের পূর্বাভাস এবং চিকিত্সার জন্য আরেকটি লক্ষ্য প্রদান করে।
মানসিক চাপের সাথে খাপ খাইয়ে নেওয়ার ক্ষমতা ক্যান্সার কোষের বেঁচে থাকা এবং বিস্তারের একটি গুরুত্বপূর্ণ বৈশিষ্ট্য।কঠোর মাইক্রোএনভায়রনমেন্টে ক্যান্সারের দ্রুত বিস্তার এবং বিপাকীয় বৈশিষ্ট্য- পুষ্টির অভাব, হাইপোক্সিয়া এবং কম পিএইচ- যা কোষের মৃত্যুর সংকেত পথকে ট্রিগার করতে পারে।p535, হিট শক প্রোটিন 6, 7, KRAS8, 9, এবং HIF-110, 11, 12, 13-এর মতো স্ট্রেস-সংবেদনশীল জিনের অনিয়ম প্রায়শই ক্যান্সারে পরিলক্ষিত হয়, যার ফলে অ্যাপোপটোসিসকে অবরুদ্ধ করে এবং বেঁচে থাকার প্রচার করা হয়।
প্রোটিন কিনেস R (PKR) হল একটি গুরুত্বপূর্ণ স্ট্রেস সেন্সর এবং ইউক্যারিওটিক ইনিশিয়েশন ফ্যাক্টর 2α (eIF2α) এর সাবুনিট কিনেস, একটি অনুবাদমূলক নিয়ন্ত্রক যা কোষের মৃত্যুর সাথে সেলুলার স্ট্রেস লিঙ্ক করে।PKR মূলত একটি বিদেশী ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড RNA (dsRNA) সনাক্তকরণের মাধ্যমে একটি অ্যান্টিভাইরাল প্রোটিন হিসাবে চিহ্নিত হয়েছিল।সক্রিয় হওয়ার পরে, ভাইরাল এবং সেলুলার প্রোটিন সংশ্লেষণ 14,15,16 বাধা দেওয়ার জন্য PKR ফসফরিলেট eIF2α।PACT (PKR অ্যাক্টিভেটর প্রোটিন) dsRNA17,18,19,20,21,22,23 অনুপস্থিতিতে প্রথম PKR অ্যাক্টিভেটর প্রোটিন হিসাবে চিহ্নিত করা হয়েছে।PKR-এর সাথে সরাসরি মিথস্ক্রিয়ার মাধ্যমে, PACT বিভিন্ন স্ট্রেস (সিরাম স্টারভেশন, পারক্সাইড বা আর্সেনাইট ট্রিটমেন্ট) PKR এবং ডাউনস্ট্রিম সিগন্যালিং পাথওয়েতে স্থানান্তরিত করে।eIF2α ফসফোরিলেশন ছাড়াও, PACT-মধ্যস্থিত PKR অ্যাক্টিভেশন স্ট্রেস প্রতিক্রিয়ার সাথে যুক্ত বিভিন্ন ইভেন্টকে ট্রিগার করে, যার মধ্যে PI3K/Akt24 পাথওয়ের মাধ্যমে পরিবর্তিত রেডক্স স্ট্যাটাস, p5325,26 এর মাধ্যমে উন্নত DNA ক্ষতি পরীক্ষা এবং NF-κB27,28 ট্রান্সক্রিপশন নিয়ন্ত্রণ করে। স্ট্রেস প্রতিক্রিয়া, বিস্তার, অ্যাপোপটোসিস এবং অন্যান্য মূল সেলুলার প্রক্রিয়াগুলিতে তাদের গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকার প্রেক্ষিতে, PKR এবং PACT অনেক রোগের জন্য প্রতিশ্রুতিবদ্ধ থেরাপিউটিক লক্ষ্যমাত্রা, বিশেষ করে ক্যান্সার30,31,32,33।যাইহোক, এই প্লিওট্রপিক কার্যকরী এবং জৈবিক তাত্পর্য সত্ত্বেও, ক্যান্সার কোষগুলিতে PACT/PKR কার্যকলাপের নিয়ন্ত্রণ অধরা থেকে যায়।
lncRNA হল প্রোটিন-কোডিং সম্ভাবনা ছাড়াই 200 নিউক্লিওটাইডের চেয়ে বড় প্রতিলিপি।যেহেতু অত্যাধুনিক সমগ্র জিনোম সিকোয়েন্সিং প্রকল্পগুলি হাজার হাজার lncRNA চিহ্নিত করেছে, 35,36 তাদের জৈবিক কার্যাবলী ব্যাখ্যা করার জন্য অনেক প্রচেষ্টা করা হয়েছে।গবেষণার একটি ক্রমবর্ধমান সংস্থা দেখিয়েছে যে lncRNAs অনেক জৈবিক প্রক্রিয়ার সাথে জড়িত, যার মধ্যে রয়েছে এক্স-ক্রোমোজোম নিষ্ক্রিয়করণ 38,39, ইমপ্রিন্টিং40, ট্রান্সক্রিপশন41,42, অনুবাদ43 এবং এমনকি ক্যান্সার বৃদ্ধি44,45,46,47 এর নিয়ন্ত্রণ।এই গবেষণাগুলি জানিয়েছে যে অনেক lncRNAs PACT/PKR পথের সাথে জড়িত।এই ধরনের একটি গবেষণায় দেখা গেছে যে lncRNA ASPACT PACT ট্রান্সক্রিপশনকে বাধা দেয় এবং PACT mRNA-এর পারমাণবিক ধারণ ক্ষমতা বৃদ্ধি করে।অন্যান্য গবেষণায় দেখা গেছে যে lncRNA nc886 PKR এর সাথে আবদ্ধ হয় এবং এর ফসফোরিলেশন 49,50 বাধা দেয়।এখন পর্যন্ত, lncRNA নিয়ন্ত্রক PACT-মধ্যস্থিত PKR অ্যাক্টিভেশন রিপোর্ট করা হয়নি।
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) একটি অনকোজেনিক lncRNA51,52,53,54 হিসাবে চিহ্নিত করা হয়েছে।miP-194-5p53, miP-12952 এবং miP-532-3p51 এর নিয়ন্ত্রণের মাধ্যমে, DARS-AS1 যথাক্রমে পরিষ্কার কোষ রেনাল সেল কার্সিনোমা, থাইরয়েড কার্সিনোমা এবং নন-স্মল সেল ফুসফুস কার্সিনোমা বৃদ্ধির জন্য দেখানো হয়েছে।টং এবং সহকর্মীরা আরও দেখেছেন যে DARS-AS1 প্রোটিন 39 (RBM39) RNA- বাইন্ডিং মোটিফের স্থায়িত্ব বজায় রেখে মায়লোমা অগ্রগতি প্রচার করে।যাইহোক, এই lncRNA PACT-PKR অ্যাক্টিভেশন এবং ক্যান্সার কোষগুলির স্ট্রেস প্রতিক্রিয়া নিয়ন্ত্রণের সাথে জড়িত কিনা তা নিয়ে কোনও গবেষণা করা হয়নি।
এখানে, আমরা CRISPRi সিস্টেম ব্যবহার করে একটি বড় আকারের লস-অফ-ফাংশন স্ক্রীন সম্পাদন করেছি এবং নির্ধারণ করেছি যে DARS-AS1 lncRNA বিভিন্ন ধরণের ক্যান্সার কোষের বিস্তারকে প্রচার করে।উপরন্তু, আমরা একটি প্রধান প্রক্রিয়া চিহ্নিত করেছি: DARS-AS1 সরাসরি PACT এর সাথে আবদ্ধ হয়, PACT এবং PKR বাইন্ডিংকে বাধা দেয়, eIF2α এর ফসফোরিলেশন প্রতিরোধ করে, একটি নিম্ন PKR সাবস্ট্রেট, এবং শেষ পর্যন্ত অ্যাপোপটোটিক কোষের মৃত্যুকে বাধা দেয়।উপসংহারে, আমাদের কাজ DARS-AS1 lncRNA কে PACT-PKR পথের একটি নিয়ন্ত্রক হিসাবে এবং ক্যান্সারের চিকিত্সা এবং পূর্বাভাসের জন্য একটি সম্ভাব্য লক্ষ্য হিসাবে প্রকাশ করে।
বিস্তৃত জিনোমিক প্রোফাইলিং অধ্যয়ন ক্যান্সারের সাথে যুক্ত শত শত lncRNA সনাক্ত করেছে।যাইহোক, তাদের ফাংশন মূলত অজানা রয়ে গেছে56.ক্যান্সারের অগ্রগতির সাথে জড়িত প্রতিশ্রুতিশীল lncRNA প্রার্থীদের সনাক্ত করার জন্য, আমরা CRISPRi সিস্টেম (চিত্র 1a) ব্যবহার করে SW620 কোলোরেক্টাল ক্যান্সার সেল লাইনে কম বিস্তারের জন্য একটি ক্ষতির-ফাংশন স্ক্রীন সম্পাদন করেছি।SW480 এবং SW620 কোলন ক্যান্সার সেল লাইনের অনন্য বৈশিষ্ট্য হল যে তারা একটি একক রোগীর প্রাথমিক এবং মাধ্যমিক টিউমার থেকে উদ্ভূত হয়।এটি উন্নত কোলন ক্যান্সারের অগ্রগতিতে জেনেটিক পরিবর্তনগুলি অধ্যয়নের জন্য একটি মূল্যবান তুলনা প্রদান করে।অতএব, আমরা আরএনএ সিকোয়েন্সিং ব্যবহার করে কোলোরেক্টাল ক্যান্সার সেল লাইনের (SW480 এবং SW620) ট্রান্সক্রিপ্টোমগুলি বিশ্লেষণ করেছি এবং প্রকাশিত সাহিত্য থেকে কিছু সম্ভাব্য কার্যকরী lncRNA সংগ্রহ করেছি।এই ফলাফলগুলির উপর ভিত্তি করে, আমরা একটি পুল করা sgRNA লাইব্রেরি ডিজাইন করেছি যার মধ্যে 7355 sgRNA অলিগো রয়েছে যা লক্ষ্য করে 971 ক্যান্সার-সম্পর্কিত lncRNAs এবং 500টি অলক্ষ্যবিহীন sgRNA অলিগোকে একটি নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণের জন্য লক্ষ্য করে (পরিপূরক ডেটা 1)।
CRISPRi সিস্টেম ব্যবহার করে স্ক্রীনিং এর পরিকল্পিত উপস্থাপনা।b স্ক্রীনিংয়ের পরে sgRNA সমৃদ্ধকরণ।অনুভূমিক বিন্দুযুক্ত রেখাটি log2 (ভাঁজ পরিবর্তন) = ±0.58 প্রতিনিধিত্ব করে।উল্লম্ব ডটেড লাইন p মান = 0.05 নির্দেশ করে।কালো বিন্দুগুলি অ-টার্গেট sgRNA (NC হিসাবে মনোনীত) প্রতিনিধিত্ব করে।লাল বিন্দু হল DARS-AS1 কে লক্ষ্য করে sgRNA।নীল বিন্দুগুলি হল LINC00205 কে লক্ষ্য করে sgRNA, পূর্বে বর্ণিত অনকোজেনিক lncRNA।ভাঁজ পরিবর্তন = (স্বাভাবিক পড়া, দিন 17)/(স্বাভাবিক পড়া, দিন 0)।c DARS-AS1 sgRNA নকডাউন কোষের বৃদ্ধিকে বাধা দেয়।ত্রুটি বার তিনটি পরীক্ষার ± আদর্শ বিচ্যুতি প্রতিনিধিত্ব করে।* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 টু-টেইল্ড স্টুডেন্টস টি-টেস্ট।d টিউমারে DARS-AS1 এক্সপ্রেশন (TCGA ডেটাসেট)।BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, এবং COAD, যথাক্রমে (TCGA ডেটাসেট) রোগীদের থেকে জোড়া স্বাভাবিক এবং টিউমার নমুনায় DARS-AS1-এর প্রকাশ।পি-মানগুলি জোড়াযুক্ত টু-টেইল্ড স্টুডেন্টস টি-টেস্ট ব্যবহার করে প্রাপ্ত হয়েছিল।
প্লাজমিড তৈরি এবং লেন্টিভাইরাস প্যাকেজ করার পরে, আমরা চারটি স্বাধীন সংক্রমণ পরীক্ষায় উপরের লাইব্রেরির সাথে dCas9-SW620 কোলোরেক্টাল ক্যান্সার সেল লাইনকে স্থানান্তরিত করেছি।এই সংক্রমণের জন্য বহুবিধ সংক্রমণ (MOI) ছিল 0.1–0.3, যা নির্দেশ করে যে প্রতিটি কোষ শুধুমাত্র একটি sgRNA দিয়ে স্থানান্তরিত হতে পারে।18 দিনের ইন ভিট্রো কালচারের পরে, স্ক্রীনিংয়ের পরে টার্গেট এসজিআরএনএগুলির সমৃদ্ধকরণ প্রোফাইল হ্রাস পেয়েছে বা বৃদ্ধি পেয়েছে, যখন অ-লক্ষ্যযুক্ত নিয়ন্ত্রণ অলিগোনিউক্লিওটাইডের সংখ্যা প্রাক-স্ক্রীনিং প্রোফাইলের তুলনায় তুলনামূলকভাবে অপরিবর্তিত রয়েছে, এটি নির্দেশ করে যে আমাদের লক্ষ্যে একটি উচ্চ স্ক্রিন-নির্দিষ্ট রয়েছে। লাইব্রেরিভাত।1b এবং সম্পূরক টেবিল 1)। LINC00205, যা পূর্বে ফুসফুসের ক্যান্সার এবং লিভার ক্যান্সারের অগ্রগতি 58,59,60 প্রচারের জন্য রিপোর্ট করা হয়েছিল, এই স্ক্রীনিংয়ের নির্ভরযোগ্যতা নিশ্চিত করে (লগ 2 (ভাঁজ পরিবর্তন) < −0.58, পি মান <0.05) স্ক্রীন করা হয়েছিল (চিত্র 1b)। LINC00205, যা পূর্বে ফুসফুসের ক্যান্সার এবং লিভার ক্যান্সারের অগ্রগতি 58,59,60 প্রচারের জন্য রিপোর্ট করা হয়েছিল, এই স্ক্রীনিংয়ের নির্ভরযোগ্যতা নিশ্চিত করে (লগ 2 (ভাঁজ পরিবর্তন) < −0.58, পি মান <0.05) স্ক্রীন করা হয়েছিল (চিত্র 1b)। LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1খ)। LINC00205, পূর্বে ফুসফুসের ক্যান্সার এবং লিভার ক্যান্সারের অগ্রগতি প্রচারের জন্য রিপোর্ট করা হয়েছিল 58,59,60, বাদ দেওয়া হয়েছিল (log2 (ভাঁজ পরিবর্তন) <-0.58, p-মান <0.05), এই স্ক্রীনিংয়ের দৃঢ়তা নিশ্চিত করে (চিত্র .1b) . Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 肺癌 和 进展 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （（（（（（（（变化） <-0.58 ， পি 值 <0.05）。。 图 图 证实 了 了 了 可靠性 可靠性 可靠性 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 肺癌 和 进展 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （（（（（（（（变化） <-0.58 ， পি 值 <0.05）。。 图 图 证实 了 了 了 可靠性 可靠性 可靠性 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1খ)। LINC00205, পূর্বে ফুসফুস এবং যকৃতের ক্যান্সারের অগ্রগতি প্রচারের জন্য রিপোর্ট করা হয়েছিল58,59,60, বাদ দেওয়া হয়েছিল (log2 (ভাঁজ পরিবর্তন) <-0.58, p-মান <0.05), এই স্ক্রীনিংয়ের দৃঢ়তা নিশ্চিত করে (চিত্র .1b)।
পরীক্ষিত সমস্ত lncRNA গুলির মধ্যে, DARS-AS1ও স্ক্রীন করা হয়েছিল, যেখানে তিনটি জ্ঞানীয় sgRNA অলিগোনিউক্লিওটাইডগুলি 18 দিনের সংস্কৃতির পরে উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে, পরামর্শ দেয় যে এই lncRNA এর নকডাউনের ফলে ক্যান্সারের বিস্তার হ্রাস পেয়েছে (চিত্র 1b)।এই ফলাফলটি কোলোরেক্টাল ক্যান্সার কোষগুলিতে এমটিএস বিশ্লেষণের দ্বারা আরও সমর্থিত ছিল যা দেখায় যে DARS-AS1 নকডাউন কোষগুলির বৃদ্ধির হার নিয়ন্ত্রণ কোষের তুলনায় অর্ধেক ছিল (চিত্র 1c) এবং অন্যান্য বিভিন্ন ধরণের ক্যান্সারের পূর্ববর্তী প্রতিবেদনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ ছিল।: পরিষ্কার কোষ কিডনি ক্যান্সার, থাইরয়েড ক্যান্সার এবং নন-স্মল সেল ফুসফুসের ক্যান্সার51,52,53,55।যাইহোক, কোলোরেক্টাল ক্যান্সারে এর কার্যকারিতা এবং আণবিক প্রক্রিয়াগুলি অনাবিষ্কৃত থাকে।অতএব, আমরা আরও অধ্যয়নের জন্য এই lncRNA বেছে নিয়েছি।
রোগীদের মধ্যে DARS-AS1 এক্সপ্রেশন অধ্যয়ন করার জন্য, আমরা ক্যান্সার জিনোম অ্যাটলাস (TCGA) প্রকল্প থেকে 10,327 টি টিউমার নমুনা ব্যাপকভাবে বিশ্লেষণ করেছি।আমাদের ফলাফলগুলি দেখায় যে DARS-AS1 কোলন অ্যাডেনোকার্সিনোমা (COAD), রেনাল ক্লিয়ার সেল কার্সিনোমা (KIRC), এবং রেনাল প্যাপিলারি সেল কার্সিনোমা (KIRP) সহ বিভিন্ন টিউমারের স্বাস্থ্যকর কোষগুলিতে ব্যাপকভাবে প্রকাশিত এবং উল্লেখযোগ্যভাবে উন্নীত হয়।.খুব কম (চিত্র 1d এবং পরিপূরক চিত্র 1a, b)। জোড়াযুক্ত স্বাস্থ্যকর/টিউমার নমুনার বিশ্লেষণ আরও নিশ্চিত করেছে যে মূত্রাশয় ইউরোথেলিয়াল কার্সিনোমা (BLCA), কিডনি রেনাল ক্লিয়ার সেল কার্সিনোমা (KIRC), প্রোস্টেট অ্যাডেনোকার্সিনোমা (PRAD), ফুসফুসের স্কোয়ামাস সেল কার্সিনোমা (LUSC) এর টিউমারগুলিতে DARS-AS1-এর একটি উল্লেখযোগ্যভাবে উচ্চ অভিব্যক্তি রয়েছে। , জরায়ু কর্পাস এন্ডোমেট্রিয়াল কার্সিনোমা (UCEC), ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমা (LUAD), লিভার হেপাটোসেলুলার কার্সিনোমা (LIHC), কিডনি রেনাল প্যাপিলারি সেল কার্সিনোমা (KIRP), এবং কোলন অ্যাডেনোকার্সিনোমা (COAD) (p মান <0.05) (চিত্র 1e) . জোড়াযুক্ত স্বাস্থ্যকর/টিউমার নমুনার বিশ্লেষণ আরও নিশ্চিত করেছে যে মূত্রাশয় ইউরোথেলিয়াল কার্সিনোমা (BLCA), কিডনি রেনাল ক্লিয়ার সেল কার্সিনোমা (KIRC), প্রোস্টেট অ্যাডেনোকার্সিনোমা (PRAD), ফুসফুসের স্কোয়ামাস সেল কার্সিনোমা (LUSC) এর টিউমারগুলিতে DARS-AS1-এর একটি উল্লেখযোগ্যভাবে উচ্চ অভিব্যক্তি রয়েছে। , জরায়ু কর্পাস এন্ডোমেট্রিয়াল কার্সিনোমা (UCEC), ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমা (LUAD), লিভার হেপাটোসেলুলার কার্সিনোমা (LIHC), কিডনি রেনাল প্যাপিলারি সেল কার্সিনোমা (KIRP), এবং কোলন অ্যাডেনোকার্সিনোমা (COAD) (p মান <0.05) (চিত্র 1e) .জোড়াযুক্ত স্বাস্থ্যকর/টিউমার নমুনার বিশ্লেষণ মূত্রাশয় ইউরোথেলিয়াল কার্সিনোমা (BLCA), ক্লিয়ার সেল রেনাল এবং রেনাল সেল কার্সিনোমা (KIRC), প্রোস্টেট অ্যাডেনোকার্সিনোমা (PRAD), ফুসফুসের স্কোয়ামাস সেল কার্সিনোমা (LUSC) টিউমারগুলিতে DARS-AS1 এর উল্লেখযোগ্যভাবে উচ্চতর প্রকাশ নিশ্চিত করেছে।, карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– মি)। , কর্পাস ইউটেরি (UCEC) এর এন্ডোমেট্রিয়াল কার্সিনোমা, ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমা (LUAD), লিভারের হেপাটোসেলুলার কার্সিনোমা (LIHC), কিডনির প্যাপিলারি সেল কার্সিনোমা (KIRP), এবং কোলনের অ্যাডেনোকার্সিনোমা (COAD) (p মান < 0.05) (চিত্র 1e–মি)।健康 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 了 দারস-এএস 1 在 膀胱 尿路 尿路 上 (বিএলসিএ) 、 肾 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 、 、 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 肺鳞状 肺鳞状 肺鳞状 (LUSC) 肿瘤 中 的 的 的 中 中 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 的 的 的 的 的显着 更 高 表达 ， 子宫体子宫 内膜 癌 （ইউসিইসি） ， 肺腺癌 （লুয়াদ） ， 肝肝 细胞癌 （lihc） ， ， 肾 肾 （（KIRP）） （（（（（（（（（（（P 值 P （（P （（P 值 （P 值 （P 值 （P 值 （P 值<0.05）（图1e-m）।配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 了 了 了 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌(luc)癌 (কির্প) （কোড） (পি 值<0.05）） (图1e-m）)।স্বাস্থ্যকর/টিউমার যুক্ত নমুনার বিশ্লেষণ মূত্রাশয় ইউরোথেলিয়াল কার্সিনোমা (BLCA), ক্লিয়ার সেল রেনাল সেল কার্সিনোমা (KIRC), প্রোস্টেট অ্যাডেনোকার্সিনোমা (PRAD), এবং ফুসফুসের স্কোয়ামাস সেল কার্সিনোমা (LUSC) টিউমারগুলিতে DARS-AS1 এর ভূমিকাকে আরও সমর্থন করে।экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -মি)। কর্পাস জরায়ু কার্সিনোমা (UCEC), ফুসফুসের অ্যাডেনোকার্সিনোমা (LUAD), হেপাটোসেলুলার কার্সিনোমা (LIHC), রেনাল প্যাপিলারি সেল কার্সিনোমা (KIRP), এবং কোলন অ্যাডেনোকার্সিনোমা (COAD) (p মান <0.05) (চিত্র 1e -m) এর অভিব্যক্তি।একসাথে নেওয়া, এই ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে DARS-AS1 বিভিন্ন ধরণের ক্যান্সারে ব্যাপকভাবে এবং অত্যন্ত প্রকাশ করা হয়।
যেহেতু DARS-AS1 এবং DARS (এন্টিসেন্স স্ট্র্যান্ডের এনকোডিং জিন) একই প্রোমোটার ভাগ করে এবং একে অপরের পাশে অবস্থিত, আমরা shRNA ডিজাইন করেছি বিশেষভাবে DARS-AS1 কে নকডাউন করার জন্য কিন্তু DARS নয় (পরিপূরক চিত্র 2a,b এবং পরিপূরক সারণী 2) .SW620 ছাড়াও, আমরা shRNA নকডাউন (পরিপূরক সারণী 3) এর কার্যকারিতা এবং কার্যকারিতা অধ্যয়ন করার জন্য DARS-AS1 উচ্চভাবে প্রকাশকারী তিনটি সেল লাইন ব্যবহার করেছি।আমাদের ফলাফলগুলি ইঙ্গিত করে যে সমস্ত তিনটি shRNA গুলিই DARS mRNA (পরিপূরক চিত্র 2c–f) পরিমাণের উপর সামান্য প্রভাব সহ কমপক্ষে 80% DARS-AS1 নকডাউন দক্ষতা অর্জন করেছে।উপরন্তু, আমরা দেখতে পেয়েছি যে এই shRNAs-এর সাথে DARS-AS1 নকডাউন উল্লেখযোগ্যভাবে কোলোরেক্টাল ক্যান্সার সেল লাইন SW620 (49.7%) এবং HCT116 (27.7%), স্তন ক্যান্সার সেল লাইন MBA-MD-231 (53.4%) কোষের বৃদ্ধিকে বাধা দেয়।) এবং HepG2 হেপাটোমা সেল লাইন (92.7% হ্রাস), সেইসাথে তাদের আন্যাঙ্করড গোলক গঠনের ক্ষমতা (গড় ~50.8%, 44.6%, 40.7% এবং 75.7% প্রতি সেল লাইন) (চিত্র 2a,b)।SW620-এ, উপনিবেশ গঠনের পরীক্ষা-নিরীক্ষার ফলাফল আরও নিশ্চিত করেছে যে DARS-AS1 shRNA প্রায় 69.6% (চিত্র 2c) গড় হ্রাসের সাথে কোষের বিস্তারকে উল্লেখযোগ্যভাবে বাধা দেয়।
SW620, HCT116, MBA-MD-231, এবং HepG2 কোষে কোষের বিস্তার (a) এবং গোলক গঠনের (b) উপর shRNA এবং DARS-AS1 shRNA নিয়ন্ত্রণের প্রভাব।c SW620 কোষে উপনিবেশ গঠনের উপর নিয়ন্ত্রণ shRNA এবং DARS-AS1 shRNA এর প্রভাব।কোষের বিস্তার (d), গোলক গঠন (e), এবং SW620 কোষের উপনিবেশ গঠন (f) DARS-AS1-কে অতিমাত্রায় প্রকাশ করে।দেখানো ডেটা হল তিনটি পরীক্ষার গড় ± আদর্শ বিচ্যুতি।* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, এবং *** p ≤ 0.001 দ্বারা টু-টেইল্ড স্টুডেন্টস টি-টেস্ট।
লস-অফ-ফাংশন অধ্যয়নের পরিপূরক করার জন্য, আমরা পরবর্তীতে DARS-AS1 (পরিপূরক চিত্র 2g) ওভার এক্সপ্রেসিং SW620 কোষ তৈরি করেছি।DARS-AS1 ওভার এক্সপ্রেশন উল্লেখযোগ্যভাবে SW620 কোষে কোষের বৃদ্ধি (1.8-গুণ), অনাঙ্করিত গোলক গঠন (1.4-গুণ), এবং উপনিবেশ গঠন (3.3-গুণ) বৃদ্ধি করেছে (চিত্র 2d–f)।আমরা আরেকটি DARS-AS1 এক্সপ্রেসিং সেল লাইন, A549 ব্যবহার করে এই ফলাফল নিশ্চিত করেছি।DARS-AS1 ওভার এক্সপ্রেশনের কারণে এই বর্ধিত কোষের বিস্তার আরও A549 কোষগুলিতে পরিলক্ষিত হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 2h, i এবং পরিপূরক সারণী 3)।একসাথে নেওয়া, এই লাভ এবং ক্ষতি অধ্যয়নগুলি দেখায় যে DARS-AS1 ভিট্রোতে ক্যান্সার কোষের বিস্তারকে প্রচার করে।
অন্তর্নিহিত প্রক্রিয়াটি অন্বেষণ করতে যার দ্বারা DARS-AS1 কোষের বিস্তার নিয়ন্ত্রণ করে, আমরা এর সম্ভাব্য প্রোটিন-বাইন্ডিং অংশীদারদের সনাক্ত করতে একটি RNA পুল-ডাউন বিশ্লেষণ করেছি।RT-qPCR ফলাফল দেখিয়েছে যে DARS-AS1 এর প্রায় 86.2% SW620 কোষের সাইটোপ্লাজমে অবস্থিত (পরিপূরক চিত্র 3a)।ইন ভিট্রো ট্রান্সক্রাইবড বায়োটিনিলেটেড DARS-AS1 বা pseudoRNA তারপর SW620 সেল লাইসেট দিয়ে ইনকিউবেট করা হয়েছিল এবং SDS-PAGE আলাদা করা হয়েছিল।পরবর্তী রূপালী দাগ দেখায় যে DARS-AS1 পুল নমুনায় একটি স্বতন্ত্র ব্যান্ড (~38 kDa) উল্লেখযোগ্যভাবে সমৃদ্ধ হয়েছে কিন্তু ডামি RNA বা পুঁতির নমুনায় নয় (চিত্র 3a)।এই ব্যান্ডটিকে গণ স্পেকট্রোমেট্রি (MS) দ্বারা একটি PKR অ্যাক্টিভেটিং প্রোটিন (PACT) হিসাবে চিহ্নিত করা হয়েছিল এবং SW620, HCT116, এবং HepG2 সেল লাইনে (চিত্র 3a,b) ইমিউনোব্লটিং দ্বারা আরও নিশ্চিত করা হয়েছিল।DARS এবং সম্পর্কিত PACT প্রোটিনগুলির সমৃদ্ধি - PKR এবং TRBP - এছাড়াও ওয়েস্টার্ন ব্লটিং (WB) দ্বারা RNA বিশ্লেষণ ব্যবহার করে তদন্ত করা হয়েছিল।ফলাফলগুলি ইঙ্গিত করে যে DARS-AS1 RNA এবং এই তিনটি প্রোটিনের মধ্যে কোন সরাসরি মিথস্ক্রিয়া পাওয়া যায়নি (পরিপূরক চিত্র 3b)।DARS-AS1 এবং PACT এর মধ্যে সুনির্দিষ্ট মিথস্ক্রিয়া আরও RNA ইমিউনোপ্রেসিপিটেশন (RIP) বিশ্লেষণ দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছিল, যা দেখায় যে DARS-AS1 অ্যান্টি-PACT অ্যান্টিবডিগুলিতে উল্লেখযোগ্যভাবে সমৃদ্ধ ছিল কিন্তু অন্যান্য নিয়ন্ত্রণ RNAs (চিত্র 3c) নয়।অন্য কোনো সেলুলার উপাদানের অনুপস্থিতিতে DARS-AS1 PACT এর সাথে সরাসরি ইন্টারঅ্যাক্ট করে কিনা তা নির্ধারণ করতে, একটি ইন ভিট্রো বায়োলেয়ার ইন্টারফেরোমেট্রি (BLI) অ্যাস পরিশোধিত PACT ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল।বায়োটিন-লেবেলযুক্ত DARS-AS1 বা ডামি আরএনএ স্ট্রেপ্টাভিডিন (এসএ) বায়োসেন্সরগুলিতে স্থির করা হয়েছিল এবং তারপরে 1 μM PACT ধারণকারী গতিশীল বাফারে ইনকিউব করা হয়েছিল।উল্লেখযোগ্যভাবে, PACT DARS-AS1 (KD মান ~26.9 nM) এর সাথে দৃঢ়ভাবে আবদ্ধ, কিন্তু RNA (চিত্র 3d) অনুকরণ করে না।একসাথে নেওয়া, এই ফলাফলগুলি DARS-AS1 এবং PACT এর মধ্যে একটি সরাসরি মিথস্ক্রিয়া এবং উচ্চ সখ্যতা প্রদর্শন করে।
RNA পুল বিশ্লেষণ SW620 কোষে PACT এর সাথে ইন্টারঅ্যাক্ট করে DARS-AS1 চিহ্নিত করেছে।উপরে, সম্পর্কিত প্রোটিনের রূপালী দাগ।নিম্ন ইমিউনোব্লটগুলি অ্যান্টি-PACT অ্যান্টিবডি দিয়ে সঞ্চালিত হয়েছিল।b RNA পুল-ডাউন বিশ্লেষণ HCT116 (শীর্ষ) এবং HepG2 (নীচের) কোষগুলিতে সম্পাদিত হয়েছিল।ইমিউনোব্লটিং দ্বারা PACT সমৃদ্ধকরণ সনাক্ত করা হয়েছিল।সিআরএনএ ইমিউনোপ্রেসিপিটেশন (আরআইপি) অ্যাসগুলি নির্দেশিত অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে SW620 কোষে সঞ্চালিত হয়েছিল।বায়োলেয়ার ইন্টারফেরোমেট্রি (BLI) ব্যবহার করে পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের DARS-AS1 বা নিয়ন্ত্রণ RNA-তে PACT বাইন্ডিং কার্ভগুলি প্রাপ্ত হয়েছিল।আরএনএ একটি স্ট্রেপ্টাভিডিন বায়োসেন্সরে স্থির ছিল।1 μM PACT অ্যাসোসিয়েশন পরিমাপ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।e আরএনএ পুল অ্যাস বায়োটিনিলেটেড পূর্ণ-দৈর্ঘ্য DARS-AS1 বা ছাঁটা (শীর্ষ) ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল।ইমিউনোব্লট PACT প্রাপ্ত (নীচে) দেখাচ্ছে।f বিশুদ্ধ পতাকাযুক্ত PACT বায়োটিনিলেটেড পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের DARS-AS1 দিয়ে ইনকিউবেট করা হয়েছিল বা ইন ভিট্রো আরআইপি অ্যাসের জন্য ছাঁটাই করা হয়েছিল (ই হিসাবে)।নিষ্কাশিত আরএনএ RT-qPCR দ্বারা যাচাই করা হয়েছিল।g PACT এর জন্য বিভিন্ন RNA খণ্ডের আপেক্ষিক সখ্যতা বায়োলেয়ার ইন্টারফেরোমেট্রি ব্যবহার করে প্রাপ্ত হয়েছিল।বিশ্লেষণের জন্য, 100 nM RNA এবং 1 μM RAST ব্যবহার করা হয়েছিল।h ইন ভিট্রো RIP অ্যাসেসগুলি বিশুদ্ধ অক্ষত বা ছাঁটা লেবেলযুক্ত PACT ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল।নিষ্কাশিত আরএনএ RT-qPCR দ্বারা যাচাই করা হয়েছিল।i SW620 কোষের বৃদ্ধির হার DARS-AS1, PACT, বা উভয়কেই বেশি প্রকাশ করে।j SW620 কোষে পূর্ণ-দৈর্ঘ্য বা ছাঁটাই করা DARS-AS1-এর অত্যধিক এক্সপ্রেশন কোষের বৃদ্ধিতে বিভিন্ন প্রভাব ফেলেছিল।k অ্যাপোপটোসিস অ্যান্টি-পিএআরপি অ্যান্টিবডি সহ ইমিউনোব্লটিং দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছিল।l DARS-AS1-এর নকআউট SW620 কোষের অ্যাপোপটোসিসকে প্ররোচিত করে যেমন প্রবাহ সাইটোমেট্রি দ্বারা দেখানো হয়েছে।দেখানো ডেটা হল তিনটি পরীক্ষার গড় ± আদর্শ বিচ্যুতি। *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, টু-টেইল্ড স্টুডেন্টস টি টেস্ট দ্বারা। *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, টু-টেইল্ড স্টুডেন্টস টি টেস্ট দ্বারা। *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 টু-টেইল্ড স্টুডেন্টস টি-টেস্ট দ্বারা। *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 টু-টেইল্ড স্টুডেন্টস টি-টেস্ট দ্বারা।
আমরা তখন PACT অ্যাসোসিয়েশনের জন্য প্রয়োজনীয় DARS-AS1 অঞ্চল সনাক্ত করতে ভিট্রো ট্রান্সক্রিপশনের মাধ্যমে তিনটি বায়োটিনিলেটেড DARS-AS1 RNA খণ্ড তৈরি করেছি (চিত্র 3e)।RNA বিশ্লেষণের ফলাফল দেখায় যে প্রতিটি খণ্ড PACT এর সাথে যোগাযোগ করতে সক্ষম ছিল, কিন্তু 3′-টার্মিনাল অঞ্চল (384-768 নিউক্লিওটাইড A3 লেবেলযুক্ত) দেখায় 1-384 টিরও বেশি নিউক্লিওটাইড A1 লেবেলযুক্ত) (চিত্র 3e)।রিকম্বিন্যান্ট PACT (চিত্র 3f) ব্যবহার করে ইন ভিট্রো আরআইপি অ্যাসে অনুরূপ ফলাফল পরিলক্ষিত হয়েছিল।এই ফলাফলগুলির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, BLI ব্যবহার করে PACT এর সাথে স্থির RNA খণ্ডকে আবদ্ধ করার পরীক্ষাগুলিও দেখায় যে PACT-এর A3 (384–768 nt) (KD মান প্রায় 94.6 nM) এর জন্য উচ্চতর সম্পর্ক রয়েছে, যদিও অন্যান্য এলাকার সাথে প্রায় কোনও লিঙ্ক নেই।(চিত্র 3d)।
আমরা PACT এ সম্পর্কিত বাঁধাই অঞ্চলগুলিও পরীক্ষা করেছি।PACT-এ তিনটি কার্যকরী ডোমেন রয়েছে, যার মধ্যে দুটি সংরক্ষিত ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড RNA-বাইন্ডিং ডোমেন (dsRBD) এবং একটি তৃতীয় ডোমেন (নির্ধারিত D3) যা প্রোটিন মিথস্ক্রিয়াগুলির সক্রিয়কারী হিসাবে কাজ করে।প্রতিটি ডোমেনের lncRNA বাইন্ডিং ক্ষমতা পরীক্ষা করার জন্য, আমরা তিনটি মিউটেশন তৈরি করেছি যা তিনটি ডোমেনের প্রতিটিকে সরিয়ে দিয়েছে এবং একটি ইন ভিট্রো RIP অ্যাসে সঞ্চালন করেছে।আমাদের ফলাফলগুলি দেখিয়েছে যে PACT-এর তৃতীয় ডোমেন (D3) মুছে ফেলার ফলে অন্যান্য দুটি মিউটেশনের (চিত্র 3h) তুলনায় DARS-AS1 (অক্ষত PACT এর তুলনায় 0.11-গুণ) এর সাথে এর মিথস্ক্রিয়া উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে, এটি দেখানো হয়েছিল যে মুক্তি D3 এর DARS-এর সাথে যোগাযোগ করেছে।-AC1।একসাথে নেওয়া, এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে DARS-AS1 এবং PACT এর মধ্যে মিথস্ক্রিয়া প্রাথমিকভাবে DARS-AS1 এর 3′ শেষ এবং PACT এর D3 ডোমেনের মাধ্যমে ঘটতে পারে।
আমরা লক্ষ করেছি যে DARS-AS1 PACT অভিব্যক্তিতে কোন প্রভাব ফেলেনি এবং PACT DARS-AS1 (পরিপূরক চিত্র 3c) এর উপর কোন প্রভাব ফেলেনি।তারপরে আমরা কোষের বৃদ্ধিতে PACT নকডাউনের প্রভাব পরীক্ষা করেছি।DARS-AS1 এর বিপরীতে, PACT ছিটকে যাওয়ার সময় আপেক্ষিক কোষগুলি 1.5-3 গুণ দ্রুত বৃদ্ধি পেয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 3d)।উপনিবেশ গঠনের পরীক্ষার ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে কোষগুলি PACT (পরিপূরক চিত্র 3e) এর সাথে shRNA চিকিত্সার পরে 2-3-গুণ উপনিবেশ তৈরি করে।DARS-AS1 PACT এর মাধ্যমে কোষের বিস্তারকে নিয়ন্ত্রণ করে কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য, আমরা PACT, DARS-AS1 বা উভয়েরই বেশি এক্সপ্রেসিং SW620 কোষ তৈরি করেছি।PACT এর ওভার এক্সপ্রেশন কোষের বিস্তারের উল্লেখযোগ্য বাধা দেখিয়েছে (চিত্র 3i)।যদিও DARS-AS1 ওভার এক্সপ্রেশন প্রতি se উল্লেখযোগ্যভাবে কোষের বিস্তারকে উন্নীত করেছে, সেখানে DARS-AS1 এবং PACT-এর অতিরিক্ত এক্সপ্রেসিং কোষগুলির বৃদ্ধির হারে কোন উল্লেখযোগ্য পার্থক্য ছিল না।এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে PACT DARS-AS1 ওভার এক্সপ্রেশন দ্বারা সৃষ্ট বর্ধিত বিস্তারকে প্রতিহত করতে পারে।
যেহেতু DARS-AS1 এর বিভিন্ন অঞ্চলে বিভিন্ন PACT- বাঁধাই করার ক্ষমতা রয়েছে, তাই আমরা DARS-AS1 খণ্ডগুলির বিভিন্ন অত্যধিক প্রকাশের দ্বারা কোষের বিস্তারের উপর তাদের আপেক্ষিক প্রভাব তদন্ত করেছি।অন্য দুটি খণ্ডের তুলনায়, DARS-AS1 3′ প্রান্তে (384–768 nt), DARS-AS1-এর প্রধান PACT-সম্পর্কিত অঞ্চলে অতিরিক্ত এক্সপ্রেসড ছিল, যার কোষের বিস্তারকে উদ্দীপিত করার সর্বোচ্চ ক্ষমতা ছিল (চিত্র 3j)।এই ফলাফলগুলি DARS-AS1 এর বাইন্ডিং ক্ষমতা এবং জৈবিক ফাংশনের মধ্যে একটি ইতিবাচক সম্পর্ক নির্দেশ করে।
PACT একটি প্রো-অ্যাপোপ্টোটিক প্রোটিন 19 হিসাবে রিপোর্ট করা হয়েছে।অতএব, আমরা অ্যাপোপটোসিসে DARS-AS1 এর প্রভাব তদন্ত করেছি।প্রত্যাশিত হিসাবে, DARS-AS1 নকডাউন উল্লেখযোগ্যভাবে SW620 কোষে PARP ক্লিভেজ বাড়িয়েছে এবং SW620, HCT116, HepG2 এবং MBA-MD-231 সেল লাইনগুলিতে অ্যানেক্সিন ভি-পজিটিভ কোষের অনুপাত বাড়িয়েছে (চিত্র 3k)।3)।3f–h), নির্দেশ করে যে ক্যান্সার কোষে DARS-AS1-এর অ্যান্টি-অ্যাপোপ্টোটিক প্রভাব PACT-এর অ্যাপোপটোসিস-প্ররোচিত ফাংশনের বিপরীত।একসাথে নেওয়া, এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে DARS-AS1 অনকোজেনিক ফাংশনের প্রক্রিয়াটি PACT ফাংশনকে বাধা দেওয়ার মাধ্যমে হতে পারে।
এর পরে, আমরা DARS-AS1-PACT অ্যাসোসিয়েশনের কার্যকরী প্রভাবগুলি অন্বেষণ করেছি।PACT সরাসরি ইন্টারঅ্যাকশনের মাধ্যমে PKR সক্রিয় করার জন্য রিপোর্ট করা হয়েছে, যা পরবর্তীতে eIF2α ফসফোরিলেশন বাড়ায়, যা অনুবাদমূলক মুছে ফেলা এবং অ্যাপোপটোসিস 17 সৃষ্টি করে।প্রথমত, আমরা পরীক্ষা করেছি যে DARS-AS1 PACT এবং PKR এর সেলুলার স্থানীয়করণকে প্রভাবিত করে কিনা।কনফোকাল ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি দেখায় যে PACT এবং PKR SW620 কোষে 0.72 এর গড় পিয়ারসন পারস্পরিক সম্পর্ক সহগ সহ উচ্চমাত্রায় একত্রিত হয়েছিল।ইতিমধ্যে, DARS-AS1 ওভার এক্সপ্রেশন উল্লেখযোগ্যভাবে PACT এবং PKR সহ-স্থানীয়করণ (মানে পিয়ারসন পারস্পরিক সম্পর্ক সহগ 0.61) (চিত্র 4a) হ্রাস করেছে।DARS-AS1 PACT-PKR মিথস্ক্রিয়াকে সংশোধন করতে পারে কিনা তা তদন্ত করার জন্য, আমরা SW620 সেল লাইসেটে অ্যান্টি-PACT অ্যান্টিবডি সহ একটি সহ-ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন (কো-আইপি) অ্যাস করেছি।PKR নিয়ন্ত্রণ কোষে অ্যান্টি-PACT-এ অত্যন্ত সমৃদ্ধ ছিল, যখন PKR পুনরুদ্ধার DARS-AS1 (চিত্র 4b) ওভার এক্সপ্রেসিং কোষ থেকে লাইসেটগুলিতে উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে।বিশুদ্ধ লেবেলযুক্ত PACT এবং PKR ভিট্রো প্রোটিন বাইন্ডিং অ্যাসেসের জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল।তদনুসারে, যারা DARS-AS1 প্রদান করেছে কিন্তু কোন নিয়ন্ত্রণ নেই RNA তারা চাপা PACT-PKR ইন্টারঅ্যাকশন দেখিয়েছে (চিত্র 4c)।সমস্ত ফলাফল দেখায় যে DARS-AS1 PACT এবং PKR যোগাযোগ ব্যাহত করেছে।
কনফোকাল ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি ব্যবহার করে নিয়ন্ত্রণ কোষ বা DARS-AS1 ওভার এক্সপ্রেসিং কোষগুলিতে PACT এবং PKR-এর একটি সহ-স্থানীয়করণ পরিলক্ষিত হয়েছিল।নিউক্লিয়াস DAPI দিয়ে দাগযুক্ত ছিল।16টি ফটোগ্রাফ থেকে পরিসংখ্যানগত ফলাফল পাওয়া গেছে।b কো-ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন (কো-আইপি) কন্ট্রোল SW620 কোষের কোষের লাইসেটে অ্যান্টি-পিএক্ট অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে বা DARS-AS1-এর অতিরিক্ত এক্সপ্রেসিং কোষ।c লেবেলযুক্ত PACT, বিশুদ্ধ PKR এবং DARS-AS1 বা মক আরএনএ সহ ভিট্রোতে প্রতিলিপি করা ভিট্রো প্রোটিন বাইন্ডিং বিশ্লেষণের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল।অ্যান্টি-ফ্ল্যাগ অ্যান্টিবডি ইমিউনোপ্রিসিপিটেশনের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল।d নির্দেশিত অ্যান্টিবডি সহ ইমিউনোব্লটগুলি SW620 এবং HCT116 কোষে সঞ্চালিত হয়েছিল যা নিয়ন্ত্রণ shRNA বা DARS-AS1-shRNA দ্বারা স্থানান্তরিত হয়েছিল এবং তারপরে সিরাম ক্ষুধার্ত ছিল৷e DARS-AS1 এক্সপ্রেশন লেভেল থাপসিগারগিনের সেলুলার সংবেদনশীলতাকে পরিবর্তিত করেছে।SW620 কোষগুলি DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 ওভার এক্সপ্রেশন প্লাজমিড বা কন্ট্রোল প্লাজমিড দিয়ে স্থানান্তরিত হয়েছিল।কোষগুলিকে 48 ঘন্টার জন্য থাপসিগারগিন দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল এবং এমটিএস বিকারক ব্যবহার করে কোষের কার্যকারিতা নির্ধারণ করা হয়েছিল।f ইন ভিট্রো ট্রান্সক্রাইবড DARS-AS1 বা ডামি আরএনএ এবং পিউরিফাইড PACT ইন ভিট্রো অ্যাক্টিভেশন অ্যাসে এবং ইমিউনোব্লট সনাক্তকরণের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল।g এই অ্যান্টিবডিগুলি ব্যবহার করে ইমিউনোব্লটগুলি SW620-ctrl কোষগুলিতে (বামে) বা PKR মিউট্যান্টদের (ডানদিকে) অতিরিক্ত এক্সপ্রেসকারী কোষগুলিতে সঞ্চালিত হয়েছিল।এই কোষগুলি তারপরে নিয়ন্ত্রণ shRNA বা DARS-AS1-shRNA দ্বারা স্থানান্তরিত হয়েছিল এবং তারপরে সিরাম ক্ষুধার্ত হয়েছিল।h ফ্লো সাইটোমেট্রি দেখিয়েছে যে মিউট্যান্ট পিকেআরের নিষ্ক্রিয়তা SW620 কোষে DARS-AS1-প্ররোচিত অ্যাপোপটোসিসের জন্য ক্ষতিপূরণ দেয়।i নির্দেশিত অ্যান্টিবডি সহ ইমিউনোব্লটগুলি SW620 (বাম) বা HCT116 (ডান) কোষে সঞ্চালিত হয়েছিল।নিয়ন্ত্রণ shRNA বা DARS-AS1 shRNA দ্বারা স্থানান্তরিত কোষগুলি সিরাম-বঞ্চিত এবং 100 nM PKR C16 ইনহিবিটর বা DMSO দিয়ে পরিপূরক।স্কেল বার = 5 µm।দেখানো ডেটা হল তিনটি পরীক্ষার গড় ± আদর্শ বিচ্যুতি।* p ≤ 0.05 টু-টেইল্ড স্টুডেন্টস টি-টেস্ট।
এটি সাধারণত বিশ্বাস করা হয় যে একবার PACT PKR17 এর সাথে যোগাযোগ করে, Thr451 এ PKR ফসফোরিলেশন প্ররোচিত হতে পারে।আমাদের ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে পিকেআর ফসফোরিলেশনের স্তরটি সিরাম অনাহারের পরে DARS-AS1 নকডাউন কোষগুলিতে উল্লেখযোগ্যভাবে উন্নত হয়েছিল (চিত্র 4d এবং পরিপূরক চিত্র 4a)।তদনুসারে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে eIF2α এর ফসফোরিলেশন, প্রধান PKR সাবস্ট্রেট, এছাড়াও DARS-AS1 shRNA (চিত্র 4d এবং পরিপূরক চিত্র 4a) দ্বারা উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে।থাপসিগারগিন হল একটি ER স্ট্রেস যা ER কে Ca2+ নিঃসরণ করে।থাপসিগারগিনের সাথে চিকিত্সা PACT-এর প্রকাশ এবং সক্রিয়করণকে প্ররোচিত করে বলে জানা গেছে, যা PKR-এর সাথে আরও যোগাযোগ করে এবং সক্রিয় করে, যা eIF2α ফসফোরিলেশন 18,61 বৃদ্ধি করে অ্যাপোপটোসিসের দিকে পরিচালিত করে।এখানে, DARS-AS1 PACT/PKR পাথওয়েকে বাধা দিয়ে কোষগুলিকে চাপ কাটিয়ে উঠতে সাহায্য করতে পারে কিনা তা তদন্ত করতে আমরা PACT/PKR পথের উদ্দীপক হিসাবে থাপসিগারগিন ব্যবহার করেছি।আমরা লক্ষ্য করেছি যে DARS-AS1 এক্সপ্রেশনের স্তরটি ইতিবাচকভাবে থাপসিগারগিনের কোষ প্রতিরোধের সাথে সম্পর্কযুক্ত।SW620 কোষগুলি DARS-AS1কে অতিরিক্তভাবে প্রভাবিত করে যখন থাপসিগারগিন দিয়ে চিকিত্সা করা হয় তখন আরও ভালভাবে বেঁচে থাকে, যখন DARS-AS1 নকডাউন সহ কোষগুলি আরও সংবেদনশীল হয়ে ওঠে (চিত্র 4e)।এই ফলাফলগুলির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, DARS-AS1 ওভার এক্সপ্রেশন থ্যাপসিগারগিন-প্ররোচিত PKR ফসফোরিলেশন হ্রাস করেছে (পরিপূরক চিত্র 4b)।বিপরীতে, থ্যাপসিগারগিন চিকিত্সার পরে, PKR এবং eIF2α নিয়ন্ত্রণ কোষের তুলনায় DARS-AS1 নকডাউন কোষগুলিতে উচ্চ মাত্রায় ফসফরিলেটেড ছিল (পরিপূরক চিত্র 4b)।মজার বিষয় হল, থাপসিগারগিন ডোজ-নির্ভর পদ্ধতিতে DARS-AS1 এক্সপ্রেশনকে প্ররোচিত করেছে, যা DARS-AS1 (পরিপূরক চিত্র 4c) এর একটি স্ট্রেস-বিরোধী ফাংশন নির্দেশ করতে পারে।এছাড়াও, আমরা এই পর্যবেক্ষণগুলি নিশ্চিত করতে ভিট্রো অ্যাক্টিভেশন অ্যাসেস সম্পাদন করেছি।সংক্ষেপে, পিকেআর একটি অ্যান্টি-পিকেআর অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে সেল লাইসেটগুলি থেকে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল, তারপরে রিকম্বিন্যান্ট পিএসিটি এবং ভিট্রোতে প্রতিলিপি করা DARS-AS1 দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল।এনজাইমেটিক প্রতিক্রিয়ার পরে, ডাব্লুবি ব্যবহার করে ফসফো-পিকেআর সনাক্ত করা হয়েছিল।আমাদের ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে পিকেআর ফসফোরিলেশন উল্লেখযোগ্যভাবে DARS-AS1 দ্বারা বাধা ছিল, কিন্তু নিয়ন্ত্রণ RNA (চিত্র 4f) দ্বারা নয়।এগুলি ইন ভিট্রো এবং ভিভোর ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে DARS-AS1 PACT-মধ্যস্থিত PKR সক্রিয়করণকে বাধা দেয়।একই সময়ে, আমরা DARS-AS1 (চিত্র 4f) এর উপস্থিতিতে PACT পুনরুদ্ধারের হ্রাসও লক্ষ্য করেছি।এই ফলাফলটি ইন ভিট্রো প্রোটিন বাইন্ডিং অ্যাস (চিত্র 4c) এর ফলাফলের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ এবং আবার PACT-PKR অ্যাসোসিয়েশনের জন্য DARS-AS1 এর ব্লকিং ফাংশনকে চিত্রিত করে।
সেলুলার স্ট্রেসের অধীনে PKR অ্যাক্টিভেশনের জন্য PACT-এর D3 ডোমেনে Ser246 এবং Ser287 প্রয়োজন।অ্যালানাইনের জন্য দুটি সেরিন অবশিষ্টাংশের প্রতিস্থাপন মিউট্যান্ট PACT (mutD) দিয়েছে, যা চাপের অনুপস্থিতিতে PKR সক্রিয় করেছে এবং অ্যালানাইন (mutA) এর প্রতিস্থাপন প্রোটোকলকে বিপরীত করেছে।যেহেতু আমরা DARS-AS1 এর সাথে সরাসরি সংযোগে এই ডোমেনের গুরুত্ব প্রদর্শন করেছি, তাই এই অবশিষ্টাংশগুলি DARS-AS1 এর সাথে মিথস্ক্রিয়ায় জড়িত হতে পারে কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য আমরা এই দুটি PACT মিউট্যান্ট তৈরি করেছি।মজার বিষয় হল, উভয় মিউট্যান্টই DARS-AS1 (পরিপূরক চিত্র 4d) এর সাথে আবদ্ধ হওয়ার ক্ষমতা হারিয়ে ফেলেছিল, পরামর্শ দেয় যে DARS-AS1 এর সাথে দক্ষ মিথস্ক্রিয়া করার জন্য PACT প্রোটিনের সম্পূর্ণ কাঠামোর প্রয়োজন হতে পারে।
তদ্ব্যতীত, আমাদের ফলাফলগুলিও পরামর্শ দেয় যে DARS-AS1-shRNA-প্রেরিত কোষের বিস্তারের বাধা আংশিকভাবে একটি প্রভাবশালী নেতিবাচক PACT মিউট্যান্ট (PACTmutA) বা একটি প্রভাবশালী নেতিবাচক PKR মিউট্যান্ট (PKRmut) (পরিপূরক চিত্র 4e. e) অতিপ্রকাশ করে পুনরুদ্ধার করা যেতে পারে।প্রভাবশালী-নেতিবাচক PKR মিউট্যান্টের অত্যধিক প্রকাশ DARS-AS1 নকডাউন এবং সেইসাথে সিরাম-বঞ্চিত কোষগুলিতে eIF2α ফসফোরিলেশন দ্বারা প্ররোচিত PKR ফসফোরিলেশন হ্রাস করে (চিত্র 4g)।আরও গুরুত্বপূর্ণভাবে, DARS-AS1 নকডাউন দ্বারা প্ররোচিত অ্যাপোপটোটিক কোষগুলির অনুপাতও PKRmut (চিত্র 4h এবং পরিপূরক চিত্র 4g) ওভার এক্সপ্রেসিং কোষগুলিতে হ্রাস পেয়েছে।PKR kinase কার্যকলাপের বাধা DARS-AS1 ফাংশনকেও ব্যাহত করে, কারণ ফলাফলে দেখা গেছে যে DARS-AS1 নকডাউন খুব কমই PKR এবং eIF2α ফসফোরিলেশনকে ট্রিগার করে যখন কোষগুলিকে একটি PKR-নির্দিষ্ট C16 ইনহিবিটর (চিত্র 4i এবং পরিপূরক চিত্র 4) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়।)একসাথে নেওয়া, আমাদের ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে DARS-AS1 কোষের বিস্তারকে উৎসাহিত করে, অন্তত আংশিকভাবে, PACT-মধ্যস্থিত PKR সক্রিয়করণকে বাধা দিয়ে।
টিউমারিজেনেসিসে DARS-AS1 এর ভূমিকা আরও অন্বেষণ করতে, আমরা একটি মাউস জেনোগ্রাফ্ট মডেল ব্যবহার করে ভিভো পরীক্ষায় পারফর্ম করেছি। ফলাফলগুলি দেখায় যে DARS-AS1 এর নকডাউন নাটকীয়ভাবে ইঁদুরের টিউমার বৃদ্ধি হ্রাস করেছে (p মান <0.0001) (চিত্র 5a)। ফলাফলগুলি দেখায় যে DARS-AS1 এর নকডাউন নাটকীয়ভাবে ইঁদুরের টিউমার বৃদ্ধি হ্রাস করেছে (p মান <0.0001) (চিত্র 5a)। Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а)। ফলাফলগুলি দেখায় যে DARS-AS1 নকডাউন ইঁদুরের টিউমার বৃদ্ধিকে ব্যাপকভাবে হ্রাস করে (p মান <0.0001) (চিত্র 5a)।结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）।结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）। Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис. 5а)। ফলাফলগুলি দেখায় যে DARS-AS1 নকডাউন উল্লেখযোগ্যভাবে ইঁদুরের টিউমার বৃদ্ধি হ্রাস করেছে (p মান <0.0001) (চিত্র 5a)।এইভাবে, DARS-AS1 নকডাউন গ্রুপে, গড় টিউমারের পরিমাণ প্রায় 72.9% এবং গড় টিউমার ভর প্রায় 87.8% (চিত্র 5b-d) উল্লেখযোগ্য হ্রাস পেয়েছে।এই ফলাফলগুলি দৃঢ়ভাবে পরামর্শ দেয় যে DARS-AS1 উল্লেখযোগ্যভাবে ভিভোতে টিউমার বৃদ্ধির প্রচার করতে পারে।
নগ্ন ইঁদুরের কোলোরেক্টাল অনকোজেনেসিসে বিজ্ঞাপন DARS-AS1 নকডাউনের প্রভাব।বৃদ্ধি বক্ররেখা (a), টিউমার আকার (b), ওজন (c), এবং টিউমার চিত্র (d) দেখানো হয়েছে।ত্রুটি বার ± SEM প্রতিনিধিত্ব করে। n = 10। ****p < 0.0001, টু-টেইল্ড স্টুডেন্টস টি টেস্ট দ্বারা। n = 10। ****p < 0.0001, টু-টেইল্ড স্টুডেন্টস টি টেস্ট দ্বারা। n = 10। ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента। n = 10। ****p < 0.0001 টু-টেইল্ড স্টুডেন্টস টি-টেস্ট।n = 10। ****p <0.0001, 通过双尾学生t 检验। ****p <0.0001, 通过双尾学生t检验। ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p <0.0001 টু-টেইল্ড স্টুডেন্টস টি-টেস্ট।e Kaplan-Meier DARS-AS1 এক্সপ্রেশন স্তর এবং UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, এবং LGG রোগীদের সামগ্রিক বেঁচে থাকার মধ্যে পারস্পরিক সম্পর্ক বিশ্লেষণ করেছেন।রোগীদের মধ্যে DARS-AS1 এক্সপ্রেশনের উচ্চ মাত্রা শীর্ষ 50% ছিল;রোগীদের মধ্যে DARS-AS1 এক্সপ্রেশনের নিম্ন স্তরের 50% নীচে ছিল।পি-মানগুলি লগ র্যাঙ্ক পরীক্ষা ব্যবহার করে নির্ধারণ করা হয়েছিল।f প্রস্তাবিত মডেল যেখানে DARS-AS1 PACT-PKR পথ এবং টিউমার বৃদ্ধি নিয়ন্ত্রণ করে।
DARS-AS1 এর ক্লিনিকাল প্রভাবকে আরও ভালভাবে বোঝার জন্য, আমরা এর অভিব্যক্তি এবং রোগীর বেঁচে থাকার মধ্যে পারস্পরিক সম্পর্ক পরীক্ষা করেছি।TCGA ডেটাসেট বিশ্লেষণ করে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে উচ্চতর DARS-AS1 এক্সপ্রেশনটি ইউভেল মেলানোমা (UVM), রেনাল ক্রোমোফোবিয়া (KICH), রেনাল প্যাপিলারি সেল কার্সিনোমা (KIRP), মেসোথেলিওমা (MESO), মাল্টিপ্লেক্সের সাথে যুক্ত ছিল।নিম্ন বেঁচে থাকা উল্লেখযোগ্যভাবে গ্লিওব্লাস্টোমা মরফোসিস (জিবিএম) এবং নিম্ন-গ্রেড ব্রেন গ্লিওমা (এলজিজি) (চিত্র 5 ই) রোগীদের সাথে যুক্ত ছিল।এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে DARS-AS1 ক্লিনিকাল টিউমার অগ্রগতিতে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করতে পারে এবং একাধিক ক্যান্সারে একটি সম্ভাব্য ভবিষ্যদ্বাণীমূলক বায়োমার্কার হতে পারে।
এই গবেষণায়, বড় আকারের CRISPRi ফাংশনাল স্ক্রীনিং ব্যবহার করে, আমরা নির্ধারণ করেছি যে DARS-AS1 lncRNA দুটি মূল স্ট্রেস রেসপন্ডার, PACT এবং PKR নিয়ন্ত্রণ করে ক্যান্সার কোষের চাপকে কাটিয়ে ওঠে।PACT এর সাথে সরাসরি ইন্টারঅ্যাক্ট করে, DARS-AS1 PACT-মধ্যস্থিত PKR অ্যাক্টিভেশনকে বাধা দেয়, যার ফলে অ্যাপোপটোটিক কোষের মৃত্যু প্রতিরোধ করে এবং কোষের বিস্তারকে (চিত্র 5f) প্রচার করে।DARS-AS1-এর আপগ্র্যুলেশন একাধিক ধরণের ক্যান্সারে পরিলক্ষিত হয়েছে, যা পরামর্শ দেয় যে চাপযুক্ত পরিস্থিতিতে ক্যান্সার কোষের বেঁচে থাকার প্রচারের কাজটি একাধিক ধরণের ক্যান্সারের জন্য ব্যাপকভাবে প্রযোজ্য হতে পারে।
PACT কে PKR অ্যাক্টিভেটর প্রোটিন হিসাবে চিহ্নিত করা হয়েছে, এবং PACT-মধ্যস্থতা PKR অ্যাক্টিভেশন ট্রান্সক্রিপশন, অনুবাদ, অ্যাপোপটোসিস এবং অন্যান্য গুরুত্বপূর্ণ সেলুলার প্রক্রিয়াগুলি নিয়ন্ত্রণ করে স্ট্রেস প্রতিক্রিয়াতে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে।কয়েক দশক ধরে, PACT-PKR ক্যাসকেডের ক্যান্সার-নির্দিষ্ট নিয়ন্ত্রণ বোঝার চেষ্টা করা হয়েছে।এখানে, আমাদের গবেষণায় সেলুলার lncRNA DARS-AS1-এর মাধ্যমে ক্যান্সার কোষে PACT-PKR নিয়ন্ত্রণের একটি ভিন্ন প্রক্রিয়া প্রকাশ করা হয়েছে, যা সরাসরি PACT-এর সাথে আবদ্ধ হয়, PACT-PKR মিথস্ক্রিয়াকে ব্লক করে, PKR সক্রিয়করণ এবং eIF2α ফসফোরিলেশনকে বাধা দেয়, যার ফলে চাপ-প্ররোচিত অ্যাপোসিস প্রতিরোধ করে। ঘটনাক্রমে ক্যান্সারের বিস্তারকে উদ্দীপিত করে।কোষএই আবিষ্কারটি ক্যান্সারের পূর্বাভাস এবং থেরাপির জন্য সম্ভাব্য lncRNA লক্ষ্যগুলির উপর আলোকপাত করে।
আমাদের ডেটা দেখিয়েছে যে DARS-AS1 নকডাউন ফসফরিলেটেড PKR এবং eIF2α-তে উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধির সাথে কোষগুলিকে সিরাম অনাহারে সংবেদনশীল করে।এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে DARS-AS1 PACT/PKR কার্যকলাপকে বাধা দিয়ে কঠোর পরিস্থিতিতে ক্যান্সার কোষের বেঁচে থাকার প্রচার করে।ASPACT এবং nc886-এর মতো আরও বেশ কিছু নন-কোডিং RNA, PACT48 mRNA কমিয়ে বা PKR49,50,64 এর সাথে আবদ্ধ হয়ে অটোফসফোরিলেশন নিয়ন্ত্রণ করে PACT/PKR অক্ষের সাথে জড়িত।তাদের মধ্যে, DARS-AS1 PACT-PKR অ্যাসোসিয়েশনের বিঘ্নকারী হিসাবে কাজ করে।এই অধ্যয়নটি PACT/PKR অক্ষ নিয়ন্ত্রণ এবং চাপের প্রতিক্রিয়াগুলিতে lncRNA-এর ভূমিকা সম্পর্কে আমাদের বোঝার সমৃদ্ধ করে।
PACT এ তিনটি পৃথক ডোমেইন রয়েছে।প্রথম দুটি dsRBD-এর প্রতিটিই PACT-এর সাথে PKR-এর উচ্চ সম্বন্ধীয়তা অর্জনের জন্য যথেষ্ট, যখন তৃতীয় ডোমেন (D3) ভিট্রো এবং ভিভোতে PKR সক্রিয়করণের জন্য প্রয়োজন।আমাদের গবেষণায় দেখা গেছে যে DARS-AS1 অগ্রাধিকারমূলকভাবে D3 ডোমেনের সাথে ইন্টারঅ্যাক্ট করে (চিত্র 3h)।lncRNA (768 নিউক্লিওটাইডস) এর বৃহৎ আকারের পরিপ্রেক্ষিতে, DARS-AS1 D3 এর সাথে আবদ্ধ হওয়া শারীরিকভাবে dsRBD এবং PKR-এর PACT ডোমেনের মধ্যে মিথস্ক্রিয়াকে বাধা দিতে পারে, যার ফলে PACT এবং PKR-এর সংযোগকে অবরুদ্ধ করে।PACT পয়েন্ট মিউটেশন যা Ser246 এবং Ser287কে D3-তে অ্যালানাইন বা অ্যাসপার্টেট দিয়ে প্রতিস্থাপিত করেছে, DARS-AS1-এর জন্য এর বাঁধাইকারী সখ্যতাকে ব্যাহত করেছে, তাদের অ্যাসোসিয়েশনে D3-এর সামগ্রিক কাঠামোগত এবং বৈদ্যুতিক বৈশিষ্ট্যের গুরুত্বকে নির্দেশ করে।ভবিষ্যতে আরও সুনির্দিষ্ট জৈব রাসায়নিক বিশ্লেষণ এবং উচ্চ রেজোলিউশন PACT কাঠামোগত বিশ্লেষণ ব্যবহার করে এই প্রক্রিয়াটির আরও বিশদ প্রয়োজন হবে।
পূর্ববর্তী গবেষণায় রিপোর্ট করা হয়েছে যে DARS-AS1 বিভিন্ন প্রক্রিয়ার মাধ্যমে কোষের বিস্তারকে উৎসাহিত করে51,52,53।একটি উদাহরণে, তদন্তকারীরা দেখেছেন যে DARS-AS1 কিডনি ক্যান্সার কোষগুলিতে miP-194-5p লক্ষ্য করে তার অ্যান্টিসেন্স প্রোটিন-এনকোডিং DARS জিনকে আপ-রেগুলেট করেছে।যাইহোক, বর্তমান সমীক্ষায়, DARS-AS1 নকডাউন অন্তত কোলোরেক্টাল, স্তন এবং লিভার ক্যান্সার সহ একাধিক ধরণের ক্যান্সারে DARS ট্রান্সক্রিপশনে সামান্য প্রভাব ফেলেছিল।যেহেতু lncRNAs কোষ- এবং টিস্যু-নির্দিষ্ট অভিব্যক্তির ধরণগুলি প্রদর্শন করে, কার্যকরী প্রক্রিয়াগুলি ক্যান্সারের ধরন জুড়ে সংরক্ষণ করা যায় না, যা আমাদের পর্যবেক্ষণ এবং বিভিন্ন ক্যান্সারের পূর্ববর্তী মূল্যায়নের মধ্যে এই বৈপরীত্যে অবদান রাখতে পারে।বিভিন্ন শারীরবৃত্তীয় এবং রোগগত প্রক্রিয়াগুলির নির্দিষ্ট প্রক্রিয়াগুলি ব্যাখ্যা করার জন্য বিশেষ অধ্যয়নের প্রয়োজন।
ক্লিনিকাল ডেটার একটি বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে টিউমারগুলিতে DARS-AS1 অভিব্যক্তিটি ক্যান্সার রোগীদের বেঁচে থাকার সাথে বিপরীতভাবে সম্পর্কযুক্ত, যা ক্যান্সারের পূর্বাভাসে DARS-AS1/PACT/PKR অক্ষের গুরুত্বকে নির্দেশ করে।উপসংহারে, আমাদের অধ্যয়ন দেখায় যে DARS-AS1 হল PACT/PKR সংকেত অক্ষের একটি নিয়ন্ত্রক, ক্যান্সার কোষের বিস্তারকে উৎসাহিত করে, এবং স্ট্রেস প্রতিক্রিয়ার সময় অ্যাপোপটোসিসকে বাধা দেয়, যা গবেষণার আরেকটি লাইন প্রদান করে এবং সম্ভাব্য চিকিত্সাগুলিতে ভবিষ্যতের গবেষণার জন্য আগ্রহের বিষয়। .
মানব সেল লাইন SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 এবং HEK293T চীনের ন্যাশনাল সেল লাইন রিসোর্স ইনফ্রাস্ট্রাকচার থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল।সমস্ত কোষ DMEM মাধ্যমে রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 10% FBS (জেমিনি, ব্রুকলিন, NY) এবং 1% পেনিসিলিন-স্ট্রেপ্টোমাইসিন (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) 37°C, 5% CO2 এর সাথে পরিপূরক।ইনকিউবেটর
অ্যান্টি-PACT, Abcam (ab31967);অ্যান্টি-পিকেআর, আবক্যাম (ab184257);অ্যান্টি-পিকেআর (ফসফো-টি451), অ্যাবক্যাম (ab81303);অ্যান্টি-ফ্ল্যাগ, Abcam (ab125243);অ্যান্টি-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (ফসফরাস S51), Abcam (ab32157);অ্যান্টি-PACT (ফসফরাস S246), অ্যাবজেন্ট (AP7744b);অ্যান্টি-β-টিউবুলিন, CST (2128);সাধারণ মাউস IgG, CST (5415S);সাধারণ খরগোশ IgG, CST (2729S)।ওয়েস্টার্ন ব্লটিং-এর জন্য PBST-এ অ্যান্টিবডিগুলি 1:1000 এবং IP-এর জন্য 1:100 মিশ্রিত করা হয়েছিল।
sgRNA গুলি CRISPR-ERA66 নামে একটি সর্বজনীনভাবে উপলব্ধ টুল ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল।আমরা sgRNA ডেভেলপমেন্টের জন্য ডিফল্ট টুল প্যারামিটার এবং 3 kb অঞ্চলে অ্যালগরিদম কম্পিউটেড sgRNA বাইন্ডিং সাইট ব্যবহার করেছি।TSS কেন্দ্রিক।sgRNA অলিগোনিউক্লিওটাইডগুলির পুলগুলি CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) এ সংশ্লেষিত হয়েছিল এবং মানবীকৃত pgRNA প্লাজমিডগুলিতে ক্লোন করা হয়েছিল (Addgene #44248)।মোট 12 µg পুলড হিউম্যানাইজড pgRNA প্লাজমিড, 7.2 µg psPAX2 (Addgene #12260), এবং 4.8 µg pMD2.G (Addgene #12259) 5 x 106 HEKsfection HEK293cm ডিসফেক্ট ডিসফেক্ট ব্যবহার করে সহ-স্থানান্তরিত হয়েছে। সেল ( CWBIO, বেইজিং, চীন) প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসরণ করে।সংক্রমণের 48 এবং 72 ঘন্টা পরে ভাইরাসযুক্ত সুপারনাট্যান্ট সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং 0.45 µm ফিল্টারের মাধ্যমে ফিল্টার করা হয়েছিল।স্ক্রীনিংয়ের জন্য, dCas9/KRAB ফিউশন প্রোটিন প্রকাশকারী SW620 কোষগুলি ভাইরাস ট্রান্সডাকশন দ্বারা প্রাপ্ত হয়েছিল।সংশোধিত SW620 কোষগুলি 0.1-0.3 এর MOI-তে চারটি স্বাধীন সংক্রমণ পরীক্ষায় ভাইরাস লাইব্রেরিতে সংক্রামিত হয়েছিল এবং 2 দিনের জন্য 2 μg/ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) দিয়ে নমুনা নেওয়া হয়েছিল।তারপরে, স্ক্রীনিংয়ের জন্য ন্যূনতম 500 টি কোষ/sgRNA এর লাইব্রেরি কভারেজ সহ ভিট্রোতে 18 দিনের জন্য কোষগুলিকে সংস্কৃতি করা হয়েছিল।
জিনোমিক ডিএনএ QIAamp DNA ব্লাড মিডি কিট (QIAGEN, Düsseldorf, Germany; 51183) এর নির্দেশ অনুসারে বের করা হয়েছিল।মোট, লাইব্রেরি তৈরি করতে প্রতি জৈবিক পুনরাবৃত্তিতে 100 μg জিনোমিক ডিএনএ ব্যবহার করা হয়েছিল।sgRNA অঞ্চলটিকে দুটি রাউন্ড পিসিআর দ্বারা প্রশস্ত করা হয়েছিল এবং একটি বারকোডের সাথে সংযুক্ত করা হয়েছিল।
PCR পণ্যগুলি NucleoSpin® জেল এবং PCR পরিশোধন কিট (MACHEREY-NAGEL, Düren, Germany; 740609.250) ব্যবহার করে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল এবং Qubit™ HS ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড DNA সনাক্তকরণ কিট (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক; Q32854) ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল।
এমটিএস অ্যাস কোষের বিস্তার পরিমাপ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।2000 কোষ/কূপের প্রাথমিক ঘনত্বে কোষগুলি 96-কূপ প্লেটে বীজ করা হয়েছিল।মোট 4-6 দিনের জন্য নির্দিষ্ট সময়ে প্রতিদিন কোষের আপেক্ষিক সংখ্যা পরিমাপ করা হয়েছিল।প্রতিটি কূপের জন্য, 20 μl এমটিএস রিএজেন্ট (প্রোমেগা) 100 μl ডিএমইএম দিয়ে পাতলা করা হয়েছিল, 37 ডিগ্রি সেন্টিগ্রেডে 4 ঘন্টার জন্য কোষ দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল এবং তারপরে OD490 পরিমাপ করা হয়েছিল।
গোলকের গঠন বিশ্লেষণ করে আন্যাঙ্করড বৃদ্ধির ক্ষমতা আবিষ্কার করা হয়েছিল।সংক্ষেপে, shRNA DARS-AS1 বা কন্ট্রোল shRNA দ্বারা স্থানান্তরিত 2000 কোষগুলিকে প্রতি 4 দিনে মাঝারি পরিবর্তনের সাথে অতি লো সংযুক্তি মাইক্রোপ্লেটে (কর্নিং) সংস্কৃতি করা হয়েছিল।গোলকগুলি 14 দিন পরে গণনা করা হয়েছিল।DARS-AS1 ওভার এক্সপ্রেশন প্লাজমিড বা একটি কন্ট্রোল প্লাজমিড দিয়ে স্থানান্তরিত 500 টি কোষ বর্ধিতকরণ অ্যাসের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল, অন্যথায় পদ্ধতিটি অপরিবর্তিত ছিল।
Riboprobe® কম্বিনেশন সিস্টেমের (Promega P1440) নির্দেশনা অনুসারে T7 RNA পলিমারেজ এবং বায়োটিন-16-UTP (Roche 1138908910) ব্যবহার করে RNA প্রতিলিপি করা হয়েছিল।এখানে ব্যবহৃত প্রাইমারগুলি পরিপূরক সারণী 4 এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে।
প্রোটিন-কোডিং PACT বা PKR অঞ্চলগুলি pET15b (Addgene #73619) এ ক্লোন করা হয়েছিল এবং BL21 (DE3) এ রূপান্তরিত হয়েছিল।ব্যাকটেরিয়াগুলিকে রাতারাতি এলবিতে অ্যাম্পিসিলিন সরবরাহ করা হয়েছিল এবং তারপরে তাজা এলবি দিয়ে 100-গুণ মিশ্রিত করা হয়েছিল।যখন মাধ্যমটির OD600 0.8 এ পৌঁছেছে, তখন প্রোটিন অভিব্যক্তি প্ররোচিত করার জন্য 1 mM IPTG যোগ করা হয়েছিল।মৃদু ঝাঁকুনি দিয়ে রাতারাতি ইনকিউবেশনের পর (20°C এ 250 rpm), সেল পেলেটটি সেন্ট্রিফিউগেশন (4000 rpm, 10 মিনিট, 4°C) দ্বারা সংগ্রহ করা হয়েছিল।লাইসিস বাফারে (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) সেল পেলেটটি পুনরায় চালু করুন এবং 30 মিনিটের জন্য বরফের উপর সেঁকুন, তারপরে সোনিকেট (15 মিনিট, 5 সেকেন্ড চালু/বন্ধ, বরফের উপর) এবং সেন্ট্রিফিউজ (130,000) rpm)।, 30 মিনিট, 4°সে)।তারপরে সুপারনাট্যান্টটিকে নি-এনটিএ রেজিনে (কিউআইজেন) 3 বার 4 ডিগ্রি সেলসিয়াসে লোড করা হয়েছিল, ওয়াশ বাফার দিয়ে 4 বার ধুয়ে (50 মিমি ট্রিস, পিএইচ 8.0, 40 মিমি ইমিডাজল, 250 মিমি NaCl) এবং মোট 3 বার বিলুপ্ত করা হয়েছিল। 10 মিলি ইলুয়েন্ট বাফার (50 মিলিমিটার ট্রিস, পিএইচ 8.0, 250 মিমি NaCl, 300 মিমি ইমিডাজল)।বিশুদ্ধ প্রোটিন WB ব্যবহার করে নির্ধারণ করা হয়েছিল এবং ঘনত্ব নির্ধারণ করা হয়েছিল Qubit™ প্রোটিন অ্যাসে কিট (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক; Q 33212) ব্যবহার করে।
RIP অ্যাসেসগুলি পূর্বে বর্ণিত হিসাবে সম্পাদন করা হয়েছিল, পরিবর্তন সহ।সংক্ষেপে, 1x RIP বাফার (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease101000 মিলিমিটার ডিডিএম (Roche, 1 mM DTT) এবং 4 °C তাপমাত্রায় 15 মিনিটের জন্য 13,000 rpm-এ সেন্ট্রিফিউজ।এরপর সুপারনাট্যান্টকে প্রোটিন A+G ম্যাগনেটিক বিডস (মিলিপুর) দিয়ে 5 μg অ্যান্টি-PACT অ্যান্টিবডি (Abeam) বা IgG (CST) দিয়ে সংযোজিত করা হয়েছিল।পুঁতিগুলি 5x RIP বাফার দিয়ে 5 বার ধোয়া হয়েছিল, তারপর প্রোটিনেস কে (NEB) দিয়ে হজম করা হয়েছিল।আরএনএ ট্রিজল দিয়ে বের করা হয়েছিল এবং আরটি-কিউপিসিআর দ্বারা নির্ধারিত হয়েছিল।প্রাইমারগুলি পরিপূরক সারণী 5 এ উপস্থাপন করা হয়েছে।
ইন ভিট্রো আরআইপি অ্যাস একটি পরিবর্তিত স্ট্যান্ডার্ড আরআইপি অ্যাস প্রোটোকল অনুসারে সম্পাদিত হয়েছিল।ইন ভিট্রো ট্রান্সক্রাইবড RNA-এর মোট 5 pmol RIP বাফারের সাথে 1x মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং 5 মিনিটের জন্য 65° সেন্টিগ্রেডে ইনকিউবেশনের মাধ্যমে অ্যানিল করা হয়েছিল এবং তারপরে ঘরের তাপমাত্রায় ধীরে ধীরে শীতল করা হয়েছিল।মোট 5 pmol অক্ষত বা পরিবর্তিত পতাকা-লেবেলযুক্ত PACT প্রোটিন E. coli থেকে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল।4°C তাপমাত্রায় 2 ঘন্টার জন্য renatured RNA দিয়ে ইনকিউবেট করুন এবং অ্যান্টি-ফ্ল্যাগ IP-এর জন্য RIP বিশ্লেষণের জন্য উপরের পদ্ধতি অনুসরণ করুন।
আরএনএ এক্সটেনশন বিশ্লেষণের জন্য, 1xRIP বাফার দিয়ে 1×107 কোষ লাইজ করা হয়েছিল।4°C তাপমাত্রায় 15 মিনিটের জন্য 13,000 rpm-এ সেন্ট্রিফিউগেশনের পর, 4°C তাপমাত্রায় 2 ঘন্টার জন্য 30 μl স্ট্রেপ্টাভিডিন ম্যাগনেটিক বিডস (বেকম্যান) দিয়ে সুপারনাট্যান্টকে প্রিট্রিটেড করা হয়েছিল।বিশুদ্ধ লাইসেটটি তারপর খামির tRNA দিয়ে সরবরাহ করা হয়েছিল এবং 4°C তাপমাত্রায় রাতারাতি 40 pmol renatured RNA দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল, তারপর আরও 2 ঘন্টার জন্য এবং BSA এর সাথে ব্লক করা নতুন স্ট্রেপ্টাভিডিন চৌম্বকীয় পুঁতির 20 μl যোগ করা হয়েছিল।ওয়াশিং ধাপে 5x RIP বাফার সহ 4 বার এবং 1x RIP বাফার সহ 4 বার রয়েছে।সংশ্লিষ্ট প্রোটিনগুলিকে বায়োটিন ইলুশন বাফার (25 মিমি ট্রিস-এইচসিএল, পিএইচ 7.5, 12.5 মিমি ডি-বায়োটিন, পিএমএসএফ) দিয়ে নির্গত করা হয়েছিল এবং নুপেজ 4-12% বিস-ট্রিস জেল (ইনভিট্রোজেন) এ পৃথক করা হয়েছিল।সিলভার স্টেনিং (বিয়োটাইম বায়োটেকনোলজি) এর পরে, এমএস দ্বারা নির্দিষ্ট ব্যান্ড এক্সাইজ এবং বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
PACT এবং PKR-এর মধ্যে মিথস্ক্রিয়া পরীক্ষা করার জন্য কো-আইপি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।সংক্ষেপে, 1 x RIP বাফারে 1 x 107 lysed কোষকে ইনকিউব করে সুপারনাট্যান্ট লাইসেট প্রস্তুত করা হয়েছিল এবং তারপরে 13,000 rpm-এ 4°C তাপমাত্রায় 15 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউগেশন করা হয়েছিল।লাইসেটগুলি প্রোটিন A + G চৌম্বক পুঁতি দিয়ে লোড করা হয়েছিল, 5 µg অ্যান্টি-PACT অ্যান্টিবডি দিয়ে সংযোজিত হয়েছিল এবং 4°C এ রাতারাতি আলতো করে ঘোরানো হয়েছিল।পুঁতিগুলি 5×RIP বাফার দিয়ে 3 বার ধুয়ে, 1×RIP বাফার দিয়ে দুবার এবং 1×SDS বাফার দিয়ে ইলুট করা হয়েছিল।উদ্ধারকৃত প্রোটিন SDS-PAGE জেল দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং WB দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছিল।
পতাকাযুক্ত PACT এর দুটি pmol এবং PKR এর 1 pmol E. coli থেকে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল।1× RIP বাফারে পাতলা করুন এবং 10 pmol renatured RNA দিয়ে 4 °C তাপমাত্রায় 2 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেট করুন।এর পরে, তারা অতিরিক্ত দুই ঘন্টার জন্য প্রোটিন A+G ম্যাগনেটিক বিড-কনজুগেটেড অ্যান্টি-লেবেলযুক্ত অ্যান্টিবডি দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল।পুঁতিগুলি তারপর 1x RIP বাফার দিয়ে চারবার ধুয়ে এবং 1x SDS বাফার দিয়ে এলুট করা হয়েছিল।ফলস্বরূপ PACT এবং PKR WB দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছিল।