খবর

Nature.com পরিদর্শন করার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ.আপনি যে ব্রাউজার সংস্করণটি ব্যবহার করছেন তাতে সীমিত CSS সমর্থন রয়েছে৷সেরা অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি আপডেট করা ব্রাউজার ব্যবহার করার পরামর্শ দিই (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে সামঞ্জস্য মোড অক্ষম করুন)৷ইতিমধ্যে, অব্যাহত সমর্থন নিশ্চিত করতে, আমরা স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়াই সাইটটিকে রেন্ডার করব।
অ্যাক্টিভেটেড এস্টার বা ফেনক্সি র‌্যাডিক্যালের উপর ভিত্তি করে এনজাইমেটিক প্রক্সিমিটি লেবেলিং পদ্ধতিগুলি জীবন্ত কোষে উপকোষীয় প্রোটিওম এবং প্রোটিন ইন্টারঅ্যাক্টর ম্যাপ করতে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়।যাইহোক, অ্যাক্টিভেটেড এস্টারগুলি কম প্রতিক্রিয়াশীল, যার ফলে একটি বিস্তৃত লেবেলিং ব্যাসার্ধ হয় এবং পারক্সাইড চিকিত্সার দ্বারা উত্পন্ন ফেনক্সি র্যাডিকেলগুলি রেডক্স পাথওয়েতে হস্তক্ষেপ করতে পারে।এখানে আমরা একটি প্রক্সিমিটি লেবেলিং ডিপেন্ডেন্ট ফটোঅ্যাক্টিভেশন (PDPL) পদ্ধতির রিপোর্ট করি যা জেনেটিক্যালি মিনিএসওজি ফটোসেনসিটাইজার প্রোটিনকে আগ্রহের প্রোটিনের সাথে লিঙ্ক করে তৈরি করা হয়েছে।নীল আলো দ্বারা ট্রিগার এবং এক্সপোজার সময় দ্বারা নিয়ন্ত্রিত, একক অক্সিজেন উত্পন্ন হয় এবং তারপর অ্যানিলিন প্রোবের দ্বারা হিস্টিডিনের অবশিষ্টাংশের স্থানিকভাবে সমাধান করা হয়।আমরা অর্গানেল-নির্দিষ্ট প্রোটিওম ম্যাপিংয়ের মাধ্যমে এর উচ্চ বিশ্বস্ততা প্রদর্শন করি।TurboID-এর সাথে PDPL-এর পাশাপাশি তুলনা PDPL-এর আরও সুনির্দিষ্ট এবং ব্যাপক প্রোটোমিক কভারেজ দেখায়।এরপরে, আমরা রোগ-সম্পর্কিত ট্রান্সক্রিপশনাল কোঅ্যাক্টিভেটর BRD4 এবং E3 পার্কিন লিগেসে PDPL প্রয়োগ করেছি এবং পূর্বে অজানা ইন্টারঅ্যাক্টর খুঁজে পেয়েছি।ওভার এক্সপ্রেশন স্ক্রীনিং দ্বারা, দুটি অজানা সাবস্ট্রেট, Ssu72 এবং SNW1, পারকিনের জন্য চিহ্নিত করা হয়েছিল, যার অবক্ষয় সর্বব্যাপী-প্রোটিজোম পাথওয়ে দ্বারা মধ্যস্থতা করে।
প্রোটিন নেটওয়ার্কের সঠিক চরিত্রায়ন অনেক মৌলিক সেলুলার প্রক্রিয়ার অন্তর্গত।অতএব, প্রোটিন মিথস্ক্রিয়াগুলির অত্যন্ত নির্ভুল স্প্যাটিওটেম্পোরাল ম্যাপিং জৈবিক পথ, রোগের প্যাথলজি, এবং থেরাপিউটিক উদ্দেশ্যে এই মিথস্ক্রিয়াগুলিকে ব্যাহত করার জন্য একটি আণবিক ভিত্তি প্রদান করবে।এই লক্ষ্যে, জীবিত কোষ বা টিস্যুতে অস্থায়ী মিথস্ক্রিয়া সনাক্ত করতে সক্ষম পদ্ধতিগুলি অত্যন্ত আকাঙ্খিত।অ্যাফিনিটি পিউরিফিকেশন ম্যাস স্পেকট্রোমেট্রি (এপি-এমএস) ঐতিহাসিকভাবে আগ্রহের প্রোটিনের (পিওআই) বাইন্ডিং অংশীদারদের সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয়েছে।পরিমাণগত প্রোটিওমিক্স পদ্ধতির বিকাশের সাথে, Bioplex3.0 তৈরি করা হয়েছিল, AP-MS ভিত্তিক প্রোটিন নেটওয়ার্কগুলির বৃহত্তম ডাটাবেস।যদিও AP-MS অত্যন্ত শক্তিশালী, কর্মপ্রবাহে কোষের লাইসিস এবং তরলীকরণ পদক্ষেপগুলি দুর্বল এবং ক্ষণস্থায়ী বাঁধাই মিথস্ক্রিয়াগুলির প্রতি পক্ষপাতদুষ্ট এবং পোস্ট-লাইসিস আর্টিফ্যাক্টগুলি প্রবর্তন করে যেমন স্ফুরিয়াস মিথস্ক্রিয়া জোড়া যেগুলি লিসিসের আগে কম্পার্টমেন্টালাইজেশনের অভাব ছিল।
এই সমস্যাগুলি সমাধানের জন্য, ক্রসলিংকিং গ্রুপ সহ অপ্রাকৃত অ্যামিনো অ্যাসিড (UAA) এবং এনজাইমেটিক কাছাকাছি লেবেলিং (PL) প্ল্যাটফর্ম (যেমন APEX এবং BioID)5 তৈরি করা হয়েছে।যদিও UAA পদ্ধতি সফলভাবে অনেক পরিস্থিতিতে প্রয়োগ করা হয়েছে এবং সরাসরি প্রোটিন আঠালো তথ্য প্রদান করে, UAA সন্নিবেশ সাইটের অপ্টিমাইজেশন এখনও প্রয়োজন।আরও গুরুত্বপূর্ণভাবে, এটি একটি স্টোইচিওমেট্রিক লেবেলিং পদ্ধতি যা লেবেলিং ইভেন্টগুলির একটি অনুঘটক বিপরীতের অভাব রয়েছে।বিপরীতে, বায়োআইডি পদ্ধতির মতো এনজাইমেটিক পিএল পদ্ধতিগুলি ইঞ্জিনিয়ারড বায়োটিন লিগেসকে POI7 এ ফিউজ করে, যা পরবর্তীতে বায়োটিনকে সক্রিয় করে একটি প্রতিক্রিয়াশীল বায়োটিনাইল-এএমপি এস্টার মধ্যবর্তী গঠনে।এইভাবে এনজাইমটি অনুঘটক করে এবং একটি সক্রিয় বায়োটিন "ক্লাউড" প্রকাশ করে যা প্রক্সিমাল লাইসিন অবশিষ্টাংশকে লেবেল করে।যাইহোক, BioID একটি পর্যাপ্ত লেবেল সংকেত পেতে 12 ঘন্টারও বেশি সময় লাগে, যা অস্থায়ী রেজোলিউশনের সাথে এর ব্যবহার বন্ধ করে দেয়।ইস্ট ডিসপ্লের উপর ভিত্তি করে নির্দেশিত বিবর্তন ব্যবহার করে, TurboID কে BioID এর উপর ভিত্তি করে আরও দক্ষ করার জন্য ডিজাইন করা হয়েছিল, 10 মিনিটের মধ্যে বায়োটিনের সাথে দক্ষ লেবেলিংয়ের অনুমতি দেয়, আরও গতিশীল প্রক্রিয়াগুলি অধ্যয়ন করার অনুমতি দেয়।যেহেতু TurboID অত্যন্ত সক্রিয় এবং অন্তঃসত্ত্বা বায়োটিন স্তরগুলি নিম্ন-স্তরের লেবেলিংয়ের জন্য যথেষ্ট, ব্যাকগ্রাউন্ড লেবেলিং একটি সম্ভাব্য সমস্যা হয়ে দাঁড়ায় যখন এক্সোজেনাস বায়োটিন যোগ করার মাধ্যমে অত্যন্ত বর্ধিত এবং সময়মতো লেবেলিংয়ের প্রয়োজন হয়।উপরন্তু, সক্রিয় এস্টারগুলি খারাপভাবে প্রতিক্রিয়াশীল (t1/2 ~5 মিনিট), যা একটি বড় লেবেলিং ব্যাসার্ধের দিকে নিয়ে যেতে পারে, বিশেষ করে বায়োটিন 5 এর সাথে প্রতিবেশী প্রোটিনের সম্পৃক্ততার পরে। অন্য পদ্ধতিতে, ইঞ্জিনিয়ারড অ্যাসকরবেট পারক্সিডেসের জেনেটিক ফিউশন (যেমন বায়োটিন- ফেনল র্যাডিকেল এবং এক মিনিটের মধ্যে প্রোটিন লেবেল করার অনুমতি দেয় 9,10। APEX ব্যাপকভাবে সাবসেলুলার প্রোটিওম, মেমব্রেন প্রোটিন কমপ্লেক্স এবং সাইটোসোলিক সিগন্যালিং প্রোটিন কমপ্লেক্স 11,12 সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয়। যাইহোক, পেরক্সাইডের উচ্চ ঘনত্বের প্রয়োজন রেডক্স প্রোটিন বা পথকে প্রভাবিত করতে পারে, ব্যাঘাত ঘটাতে পারে। সেলুলার প্রক্রিয়া।
এইভাবে, সেলুলার পথগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে ব্যাহত না করে উচ্চ স্থানিক এবং অস্থায়ী নির্ভুলতার সাথে আরও প্রতিক্রিয়াশীল লেবেলযুক্ত-ব্যাসার্ধ দমন প্রজাতি তৈরি করতে সক্ষম একটি নতুন পদ্ধতি বিদ্যমান পদ্ধতিগুলির একটি গুরুত্বপূর্ণ সংযোজন হবে। প্রতিক্রিয়াশীল প্রজাতির মধ্যে, একক অক্সিজেন তার স্বল্প জীবনকাল এবং সীমিত বিস্তার ব্যাসার্ধের (কোষে t1/2 <0.6 µs) 13 এর কারণে আমাদের মনোযোগ জাগিয়েছে। প্রতিক্রিয়াশীল প্রজাতির মধ্যে, একক অক্সিজেন তার স্বল্প জীবনকাল এবং সীমিত বিস্তার ব্যাসার্ধের (কোষে t1/2 <0.6 µs) 13 এর কারণে আমাদের মনোযোগ জাগিয়েছে। Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного ограниченного и ограниченного и ограниченного и ограниченного. সক্রিয় ফর্মগুলির মধ্যে, একক অক্সিজেন তার স্বল্প জীবনকাল এবং সীমিত বিস্তার ব্যাসার্ধ (কোষে t1/2 <0.6 µs) 13 এর কারণে আমাদের দৃষ্টি আকর্ষণ করেছিল।在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µs）耬. 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни , и ограниченногинногим/6формация সক্রিয় ফর্মগুলির মধ্যে, একক অক্সিজেন আমাদের মনোযোগ আকর্ষণ করে কারণ এর সংক্ষিপ্ত জীবনকাল এবং সীমিত বিস্তার ব্যাসার্ধ (কোষে t1/2 <0.6 μs)।সিঙ্গলেট অক্সিজেন এলোমেলোভাবে মেথিওনাইন, টাইরোসিন, হিস্টিডিন এবং ট্রিপটোফেনকে অক্সিডাইজ করে বলে রিপোর্ট করা হয়েছে, অ্যামাইন বা থিওল ভিত্তিক প্রোবের সাথে সংযুক্তির জন্য এটিকে পোলার 14,15 করে তোলে।যদিও সিঙ্গলেট অক্সিজেন সাবসেলুলার কম্পার্টমেন্ট আরএনএ লেবেল করার জন্য ব্যবহার করা হয়েছে, অন্তঃসত্ত্বা POI প্রক্সিমিটি মার্কারগুলিকে পুনরায় ব্যবহার করার কৌশলগুলি অনাবিষ্কৃত রয়ে গেছে।এখানে, আমরা ফটোঅ্যাক্টিভেশন-নির্ভর প্রক্সিমিটি লেবেলিং (PDPL) নামে একটি প্ল্যাটফর্ম উপস্থাপন করি, যেখানে আমরা একটি মিনিএসওজি ফটোসেনসিটাইজারের সাথে মিশ্রিত POI গুলিকে আলোকিত করতে নীল আলো ব্যবহার করি এবং প্রক্সিমাল অবশিষ্টাংশগুলিকে অক্সিডাইজ করার জন্য সিঙ্গলেট অক্সিজেন জেনারেশনকে ট্রিগার করি, তারপরে রাসায়নিক প্রোবগুলিতে অক্সিডাইজ করার জন্য অ্যামাইন-ধারণকারী পরিবর্তনগুলিকে ট্রিগার করি। মধ্যবর্তী জীবন্ত কোষ।.আমরা ট্যাগ নির্দিষ্টতা সর্বাধিক করার জন্য রাসায়নিক প্রোবের একটি গ্রুপ পরীক্ষা করেছি এবং একটি খোলা প্রোটোমিক্স ওয়ার্কফ্লো ব্যবহার করে পরিবর্তন সাইটগুলি চিহ্নিত করেছি।TurboID-এর সাথে PDPL-এর পাশাপাশি তুলনা PDPL-এর আরও সুনির্দিষ্ট এবং ব্যাপক প্রোটোমিক কভারেজ দেখায়।আমরা ক্যান্সার-সম্পর্কিত এপিজেনেটিক নিয়ন্ত্রক প্রোটিন BRD4 এবং পারকিনসন্স ডিজিজ-সম্পর্কিত E3 লিগেস পার্কিন-এর জন্য সাবসেলুলার প্রোটিওমের অর্গানেল-নির্দিষ্ট মার্কার এবং সাধারণ প্রোটোম সনাক্তকরণের অর্গানেল-নির্দিষ্ট মার্কারগুলিতে প্রয়োগ করেছি, যা প্রোটিনের একটি পরিচিত এবং অজানা নেটওয়ার্ক উভয়ই নিশ্চিত করেছে। মিথস্ক্রিয়া.বড় প্রোটিন কমপ্লেক্সে E3 সাবস্ট্রেট চিনতে PDPL-এর ক্ষমতা এমন একটি পরিস্থিতির প্রতিনিধিত্ব করে যেখানে পরোক্ষ বাইন্ডারের স্বীকৃতি প্রয়োজন।ইউবিকিউটিনেশন-প্রোটিসোম দ্বারা মধ্যস্থতা করা দুটি অজানা পার্কিন সাবস্ট্রেট সিটুতে নিশ্চিত করা হয়েছে।
ফটোডাইনামিক থেরাপি (PDT)19 এবং ক্রোমোফোর-সহায়তা লেজার নিষ্ক্রিয়করণ (CALI)20, যেখানে ফটোসেনসিটাইজারগুলির সাথে আলোক বিকিরণ একক অক্সিজেন তৈরি করে, লক্ষ্য প্রোটিন নিষ্ক্রিয় করতে পারে বা কোষের মৃত্যুর কারণ হতে পারে।যেহেতু সিঙ্গলেট অক্সিজেন একটি অত্যন্ত প্রতিক্রিয়াশীল পদার্থ যার তাত্ত্বিক প্রসারণ দূরত্ব প্রায় 70 এনএম, ফটোসেনসিটাইজারের চারপাশে স্থানিকভাবে সীমিত জারণ নিয়ন্ত্রণ করা যেতে পারে।এই ধারণার উপর ভিত্তি করে, আমরা জীবন্ত কোষে প্রোটিন কমপ্লেক্সের ঘনিষ্ঠ লেবেল অর্জনের জন্য সিঙ্গলেট অক্সিজেন ব্যবহার করার সিদ্ধান্ত নিয়েছি।আমরা চারটি কার্য সম্পাদন করার জন্য একটি PDPL কেমোপ্রোটোমিক পদ্ধতির বিকাশ করেছি: (1) PL এনজাইম্যাটিক পদ্ধতির অনুরূপ সক্রিয় একক অক্সিজেনের প্রজন্মকে অনুঘটক করতে;(2) হালকা দীক্ষার উপর সময়-সমাধানযোগ্য লেবেলিং প্রদান;(৩) পরিবর্তনের মাধ্যমে (৪) পটভূমি কমাতে অন্তঃসত্ত্বা কোফ্যাক্টর (যেমন বায়োটিন) ব্যবহার করা এড়িয়ে চলুন, বা পরিবেশগত চাপে কোষের এক্সপোজার কমাতে অত্যন্ত বিরক্তিকর এক্সোজেনাস রিএজেন্ট (যেমন পারক্সাইড) ব্যবহার করুন।
ফটোসেনসিটাইজারগুলিকে দুটি ভাগে ভাগ করা যেতে পারে যার মধ্যে রয়েছে ছোট আণবিক ওজনের ফ্লুরোফোরস (যেমন রোজ বেঙ্গল, মিথিলিন ব্লু)22 এবং জেনেটিকালি এনকোড করা ছোট প্রোটিন (যেমন মিনিএসওজি, কিলাররেড)23।একটি মডুলার ডিজাইন অর্জনের জন্য, আমরা POI24,25 (চিত্র 1a) এ ফটোসেনসিটাইজার (PS) প্রোটিন যোগ করে প্রথম প্রজন্মের PDPL প্ল্যাটফর্ম তৈরি করেছি।যখন নীল আলো দিয়ে বিকিরণ করা হয়, তখন একক অক্সিজেন প্রক্সিমাল নিউক্লিওফিলিক অ্যামিনো অ্যাসিডের অবশিষ্টাংশকে অক্সিডাইজ করে, যার ফলে একটি umpolung পোলারিটি হয় যা ইলেক্ট্রোফিলিক এবং অ্যামাইন প্রোব নিউক্লিওফাইলস 16,17 এর সাথে আরও প্রতিক্রিয়া করতে পারে।প্রোবটি একটি অ্যালকাইন হ্যান্ডেল দিয়ে ডিজাইন করা হয়েছে যাতে ক্লিক কেমিস্ট্রি এবং এলসি/এমএস/এমএস ক্যারেক্টারাইজেশনের জন্য নিচে টান দেওয়া যায়।
মিনিএসওজি দ্বারা মধ্যস্থতা করা প্রোটিন কমপ্লেক্সের লেবেলিংয়ের পরিকল্পিত চিত্র।নীল আলোর সংস্পর্শে এলে, miniSOG-POI প্রকাশকারী কোষগুলি একক অক্সিজেন তৈরি করে, যা ইন্টারঅ্যাকটিং প্রোটিনগুলিকে সংশোধন করে কিন্তু নন-বাইন্ডিং প্রোটিন নয়।ফটোঅক্সিডেশনের মধ্যবর্তী পণ্যগুলিকে অ্যামাইন রাসায়নিক প্রোবের রিলে লেবেল দ্বারা বাধা দেওয়া হয় যাতে সমযোজী সংযোজন তৈরি হয়।রসায়ন অনুসন্ধানের অ্যালকিনাইল গ্রুপটি LC-MS/MS পরিমাপ অনুসরণ করে পুল-ডাউন দ্বারা সমৃদ্ধকরণের জন্য ক্লিক রসায়নকে অনুমতি দেয়।b অ্যামাইন প্রোবের রাসায়নিক গঠন 1-4।c প্রোব 1-4 ব্যবহার করে মাইটোকন্ড্রিয়াল স্থানীয় মিনিএসওজি-মধ্যস্থ প্রোটিওমিক মার্কারগুলির প্রতিনিধি ফ্লুরোসেন্ট জেল বিশ্লেষণ এবং জেল ডেনসিটোমেট্রির উপর ভিত্তি করে আপেক্ষিক পরিমাণ নির্ধারণ।রাসায়নিক প্রোবের সিগন্যাল-টু-ব্যাকগ্রাউন্ড অনুপাত নীল আলো বাদে নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ পরীক্ষা ব্যবহার করে বা মিনিএসওজি এক্সপ্রেশন ছাড়াই HEK293T কোষ ব্যবহার করে মূল্যায়ন করা হয়েছিল।n = 2টি জৈবিকভাবে স্বাধীন নমুনা।প্রতিটি বিন্দু একটি জৈবিক প্রতিরূপ প্রতিনিধিত্ব করে।d নির্দেশিত PDPL উপাদানগুলির উপস্থিতি বা অনুপস্থিতিতে অপ্টিমাইজড প্রোব 3 ব্যবহার করে PDPL-এর প্রতিনিধি সনাক্তকরণ এবং পরিমাণ নির্ধারণn = 3টি জৈবিকভাবে স্বাধীন নমুনা।প্রতিটি বিন্দু একটি জৈবিক প্রতিরূপ প্রতিনিধিত্ব করে।কেন্দ্ররেখা এবং হুইস্কারগুলি গড় এবং ± আদর্শ বিচ্যুতিকে উপস্থাপন করে।CBB: Coomassie ব্রিলিয়ান্ট ব্লু।e দূর-লাল Si-DMA দাগ সহ একক অক্সিজেনের কনফোকাল ইমেজিং।স্কেল বার: 10 µm।জেল ইমেজিং এবং কনফোকাল পরীক্ষাগুলি অনুরূপ ফলাফল সহ কমপক্ষে দুবার স্বতন্ত্রভাবে পুনরাবৃত্তি হয়েছিল।
আমরা প্রথমে পরিপক্ক ফটোসেনসিটাইজার miniSOG26 এবং KillerRed23-এর ক্ষমতা পরীক্ষা করেছিলাম, HEK293T তে স্থিরভাবে প্রকাশ করা হয়েছে, একটি রাসায়নিক অনুসন্ধান হিসাবে প্রোটিওমের প্রোপারজিলামাইন লেবেলিংয়ের মধ্যস্থতা করার জন্য (পরিপূরক চিত্র 1a)।জেল ফ্লুরোসেন্স বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে মিনিএসওজি এবং নীল আলোর বিকিরণ ব্যবহার করে পুরো প্রোটিওম লেবেলিং অর্জন করা হয়েছিল, যখন কিলাররেডের সাথে কোনও দৃশ্যমান লেবেলিং পণ্য পরিলক্ষিত হয়নি।সিগন্যাল-টু-ব্যাকগ্রাউন্ড অনুপাত উন্নত করতে, আমরা তারপরে অ্যানিলিন (1 এবং 3), প্রোপিলামাইন (2), বা বেনজিলামাইন (4) ধারণকারী রাসায়নিক প্রোবের একটি সেট পরীক্ষা করেছি।আমরা লক্ষ্য করেছি যে HEK293T কোষগুলিতে নীল আলোর তুলনায় উচ্চতর ব্যাকগ্রাউন্ড সিগন্যাল ছিল, সম্ভবত অন্তঃসত্ত্বা রাইবোফ্লাভিন ফটোসেনসিটাইজার, ফ্ল্যাভিন মনোনিউক্লিওটাইড (FMN) 27 এর কারণে। অ্যানিলাইন-ভিত্তিক রাসায়নিক প্রোব 1 এবং 3 আরও ভাল নির্দিষ্টতা দিয়েছে, HEK293T স্থিরভাবে মাইটোকন্ড্রিয়াতে miniSOG প্রকাশ করছে 3 প্রোবের জন্য > 8-গুণ বৃদ্ধির সংকেত প্রদর্শন করছে, যখন RNA-লেবেলিং পদ্ধতি CAP-seq-এ ব্যবহৃত প্রোব 2 শুধুমাত্র ~2.5- প্রদর্শন করছে। ভাঁজ সংকেত বৃদ্ধি, সম্ভবত RNA এবং প্রোটিনের মধ্যে বিভিন্ন প্রতিক্রিয়াশীলতার পছন্দের কারণে (চিত্র 1b, c)। অ্যানিলাইন-ভিত্তিক রাসায়নিক প্রোব 1 এবং 3 আরও ভাল নির্দিষ্টতা দিয়েছে, HEK293T স্থিরভাবে মাইটোকন্ড্রিয়াতে miniSOG প্রকাশ করছে 3 প্রোবের জন্য > 8-গুণ বৃদ্ধির সংকেত প্রদর্শন করছে, যখন RNA-লেবেলিং পদ্ধতি CAP-seq-এ ব্যবহৃত প্রোব 2 শুধুমাত্র ~2.5- প্রদর্শন করছে। ভাঁজ সংকেত বৃদ্ধি, সম্ভবত RNA এবং প্রোটিনের মধ্যে বিভিন্ন প্রতিক্রিয়াশীলতার পছন্দের কারণে (চিত্র 1b, c)।অ্যানিলাইন-ভিত্তিক রাসায়নিক প্রোব 1 এবং 3 আরও ভাল নির্দিষ্টতা দেখিয়েছে: HEK293T, যা স্থিরভাবে মাইটোকন্ড্রিয়াতে miniSOG প্রকাশ করে, প্রোব 3-এর জন্য সিগন্যালে 8-গুণেরও বেশি বৃদ্ধি দেখায়, যখন প্রোব 2, CAP-seq RNA লেবেলিং পদ্ধতিতে ব্যবহৃত হয়, শুধুমাত্র ~2.5-গুণ সংকেত বৃদ্ধি দেখায়, সম্ভবত RNA এবং প্রোটিনের মধ্যে বিভিন্ন প্রতিক্রিয়াশীলতার পছন্দের কারণে (চিত্র 1b, c)।基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性 ， HEK293T 在 线 粒体 中 稳定 表达 表达 表达 表达 表达 探针 探针 信号 增加 增加 于 于 于 于 于 于 于 方法 方法 方法 方法 方法 方法 方法 方法 方法 方法 方法 方法 方法 方法 方法 方法 方法 方法 方法 方法 方法 方法 仅 2 仅 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b,c）।基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 更 特异性 ， HEK293T 在 粒体 中 稳定 表达 মিনিসোগ ， 探针 3 的 信号 增加 增加 增加 增加 而 而 于 于 于 于 于 于 于 于 于 标记 标记 2 的 2 的 的 仅 仅 ~ ~ ~ 2. 2.5 - 倍信号增加, 可能是由于RNAঅ্যানিলাইন-ভিত্তিক রাসায়নিক প্রোব 1 এবং 3-এর আরও ভাল নির্দিষ্টতা ছিল, HEK293T স্থিরভাবে মাইটোকন্ড্রিয়াতে miniSOG প্রকাশ করেছে, এবং প্রোব 3 সিগন্যালে 8-গুণ বেশি বৃদ্ধি পেয়েছে, যখন CAP-seq RNA লেবেলিং পদ্ধতির জন্য প্রোব 2 শুধুমাত্র ~2.5-গুণ বৃদ্ধি দেখিয়েছে।সংকেতে, সম্ভবত RNA এবং প্রোটিনের মধ্যে বিভিন্ন প্রতিক্রিয়া পছন্দের কারণে (চিত্র 1b, c)।এছাড়াও, প্রোব 3 আইসোমার এবং হাইড্রাজিন প্রোবগুলি (প্রোব 5, 6, 7) পরীক্ষা করা হয়েছিল, প্রোব 3 (পরিপূরক চিত্র 1b,c) এর অপ্টিমাইজেশন নিশ্চিত করে৷একইভাবে, ইন-জেল ফ্লুরোসেন্স বিশ্লেষণ অন্যান্য অপ্টিমাইজ করা পরীক্ষামূলক পরামিতিগুলি প্রকাশ করেছে: বিকিরণ তরঙ্গদৈর্ঘ্য (460 এনএম), রাসায়নিক প্রোবের ঘনত্ব (1 মিমি), এবং বিকিরণ সময় (20 মিনিট) (পরিপূরক চিত্র 2a–c)।PDPL প্রোটোকলের কোনো উপাদান বা পদক্ষেপ বাদ দেওয়ার ফলে পটভূমিতে উল্লেখযোগ্য সংকেত উল্টে যায় (চিত্র 1d)।উল্লেখযোগ্যভাবে, সোডিয়াম অ্যাজাইড বা ট্রলক্সের উপস্থিতিতে প্রোটিন লেবেলিং উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে, যা একক অক্সিজেন নিভিয়ে দিতে পরিচিত।D2O এর উপস্থিতি, যা একক অক্সিজেনকে স্থিতিশীল করতে পরিচিত, লেবেলিং সংকেতকে উন্নত করে।লেবেলিংয়ে অন্যান্য প্রতিক্রিয়াশীল অক্সিজেন প্রজাতির অবদান তদন্ত করার জন্য, ম্যানিটল এবং ভিটামিন সি যথাক্রমে 18, 29, হাইড্রক্সিল এবং সুপারঅক্সাইড র‌্যাডিক্যাল স্ক্যাভেঞ্জার স্থাপনের জন্য যোগ করা হয়েছিল, কিন্তু তারা লেবেলিং কমাতে পাওয়া যায়নি।H2O2 এর সংযোজন, কিন্তু আলোকসজ্জা নয়, লেবেলিংয়ের ফলে হয়নি (পরিপূরক চিত্র 3a)।Si-DMA প্রোবের সাথে ফ্লুরোসেন্স সিঙ্গলেট অক্সিজেন ইমেজিং HEK293T-miniSOG তারে সিঙ্গলেট অক্সিজেনের উপস্থিতি নিশ্চিত করেছে, কিন্তু আসল HEK293T তারে নয়।উপরন্তু, mitoSOX Red আলোকসজ্জার পরে সুপারঅক্সাইড উৎপাদন সনাক্ত করতে পারেনি (চিত্র 1e এবং পরিপূরক চিত্র 3b) 30. এই তথ্যগুলি দৃঢ়ভাবে পরামর্শ দেয় যে সিঙ্গেল অক্সিজেন হল পরবর্তী প্রোটোমিক লেবেলিংয়ের জন্য দায়ী প্রধান প্রতিক্রিয়াশীল অক্সিজেন প্রজাতি।নীল আলো বিকিরণ এবং রাসায়নিক অনুসন্ধান সহ PDPL-এর সাইটোটক্সিসিটি মূল্যায়ন করা হয়েছিল এবং কোন উল্লেখযোগ্য সাইটোটক্সিসিটি পরিলক্ষিত হয়নি (পরিপূরক চিত্র 4a)।
লেবেলিং প্রক্রিয়া অধ্যয়ন করতে এবং LC-MS/MS ব্যবহার করে প্রোটিন কমপ্লেক্সগুলির প্রোটিওমিক সনাক্তকরণ সক্ষম করার জন্য, আমাদের প্রথমে নির্ধারণ করতে হবে কোন অ্যামিনো অ্যাসিডগুলি সংশোধন করা হয়েছে এবং প্রোব লেবেলের ডেল্টা ভর।মেথিওনিন, হিস্টিডিন, ট্রিপটোফান এবং টাইরোসিন একক অক্সিজেন 14,15 দ্বারা পরিবর্তিত হয়েছে বলে জানা গেছে।আমরা MSFragger32-এর উপর ভিত্তি করে FragPipe কম্পিউটিং প্ল্যাটফর্ম দ্বারা প্রদত্ত নিরপেক্ষ ওপেন অনুসন্ধানের সাথে TOP-ABPP31 কর্মপ্রবাহকে একীভূত করি।একক অক্সিজেন পরিবর্তন এবং রাসায়নিক প্রোব লেবেলিংয়ের পরে, ক্লিক কেমিস্ট্রি একটি বায়োটিন হ্রাস লেবেল ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল যাতে একটি ক্লিভেবল লিঙ্কার রয়েছে, তারপরে নিউট্রাভিডিন স্ট্রেচিং এবং ট্রিপসিন হজম হয়।পরিবর্তিত পেপটাইড, এখনও রজনে আবদ্ধ, LC-MS/MS বিশ্লেষণের জন্য ফটোক্লিভ করা হয়েছিল (চিত্র 2a এবং পরিপূরক ডেটা 1)।50 টিরও বেশি পেপটাইড মানচিত্র (PSM) তালিকাভুক্ত (চিত্র 2b) সহ প্রোটিওম জুড়ে প্রচুর পরিমাণে পরিবর্তন ঘটেছে।আশ্চর্যজনকভাবে, আমরা শুধুমাত্র হিস্টিডিনের পরিবর্তন লক্ষ্য করেছি, সম্ভবত অন্যান্য অ্যামিনো অ্যাসিডের তুলনায় অ্যানিলিন প্রোবের প্রতি অক্সিডাইজড হিস্টিডিনের উচ্চ প্রতিক্রিয়ার কারণে।একক অক্সিজেন দ্বারা হিস্টিডিন অক্সিডেশনের প্রকাশিত প্রক্রিয়া অনুসারে, 21,33 প্রস্তাবিত ব-দ্বীপ-ভর কাঠামো +229 Da দুটি অক্সিডেশনের পরে 2-অক্সো-হিস্টিডিন সহ প্রোব 3-এর যোগের সাথে মিলে যায়, যখন +247 Da হল হাইড্রোলাইসিস পণ্য। of +229 Da (পরিপূরক চিত্র 5)।MS2 বর্ণালীর মূল্যায়ন পরিবর্তিত খণ্ড আয়ন (y এবং b) (চিত্র 2c) সনাক্তকরণ সহ বেশিরভাগ y এবং b আয়নগুলির সনাক্তকরণের একটি উচ্চ নির্ভরযোগ্যতা দেখিয়েছে।PDPL-পরিবর্তিত হিস্টিডাইনগুলির স্থানীয় অনুক্রমের প্রসঙ্গ বিশ্লেষণ ±1 অবস্থানে ছোট হাইড্রোফোবিক অবশিষ্টাংশের জন্য একটি মাঝারি মোটিফ পছন্দ প্রকাশ করেছে (পরিপূরক চিত্র 4b)।গড়ে, প্রতি প্রোটিন 1.4 হিস্টিডাইন শনাক্ত করা হয়েছিল, এবং এই মার্কারগুলির সাইটগুলি দ্রাবক অ্যাক্সেসযোগ্য পৃষ্ঠ এলাকা (SASA) এবং আপেক্ষিক দ্রাবক প্রাপ্যতা (RSA) বিশ্লেষণ (পরিপূরক চিত্র 4c,d) দ্বারা নির্ধারিত হয়েছিল।
MSFragger দ্বারা চালিত FragPipe কম্পিউটিং প্ল্যাটফর্ম ব্যবহার করে অবশিষ্ট নির্বাচন অধ্যয়নের জন্য একটি নিরপেক্ষ কর্মপ্রবাহ।স্ট্রেপ্টাভিডিন রজন থেকে পরিবর্তিত পেপটাইডের ফটোক্লেভেজ করার জন্য ক্লিক কেমিস্ট্রিতে ক্লিভেবল লিঙ্কার ব্যবহার করা হয়।অসংখ্য পরিবর্তন, সেইসাথে প্রাসঙ্গিক অবশিষ্টাংশ সনাক্ত করার জন্য একটি খোলা অনুসন্ধান চালু করা হয়েছিল।b প্রোটিওম জুড়ে ঘটে যাওয়া পরিবর্তনের ভর বরাদ্দ করুন।পেপটাইড ম্যাপিং পিএসএম।c MS2 হিস্টিডিন সাইটগুলির বর্ণালী টীকা 3 প্রোবের সাথে পরিবর্তিত। একটি প্রতিনিধি উদাহরণ হিসাবে, প্রোব 3-এর সাথে একটি সমযোজী প্রতিক্রিয়া পরিবর্তিত অ্যামিনো অ্যাসিডে +229.0938 Da যোগ করেছে।d মিউটেশন অ্যাস PDPL মার্কারগুলির জন্য পরীক্ষা করতে ব্যবহৃত হয়।PRDX3 (H155A, H225A) এবং PRDX1 (H10A, H81A, H169A) অ্যান্টি-ফ্ল্যাগ সনাক্তকরণের জন্য বন্য ধরনের প্লাজমিড দিয়ে স্থানান্তরিত হয়েছিল।e প্রোব 3-এর উপস্থিতিতে সিন্থেটিক পেপটাইড পরিশোধিত মিনিএসওজি-র সাথে বিক্রিয়া করা হয়েছিল এবং Δm +247 এবং +229 এর সাথে সংশ্লিষ্ট পণ্যগুলি LC-MS স্পেকট্রামে উল্লেখ করা হয়েছিল।f ইন ভিট্রো প্রোটিন থেকে প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া মিনিএসওজি-6এক্সহিস-ট্যাগ এবং অ্যান্টি-6এক্সহিস অ্যান্টিবডি দিয়ে তৈরি।অ্যান্টিবায়োটিন (স্ট্রেপ্টাভিডিন-এইচআরপি) এবং অ্যান্টি-মাউস ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণ miniSOG-6xHis/anti-6xHis অ্যান্টিবডি কমপ্লেক্সের লেবেলযুক্ত প্রোব 3, আলোর সংস্পর্শে আসার সময়ের উপর নির্ভর করে।পৃথক প্রোটিনের লেবেলগুলি সংশ্লিষ্ট আণবিক ওজনে প্রকাশ করা হয়: এলসি অ্যান্টিবডি লাইট চেইন, এইচসি অ্যান্টিবডি ভারী চেইন।এই পরীক্ষাগুলি স্বতন্ত্রভাবে অনুরূপ ফলাফলের সাথে কমপক্ষে দুবার পুনরাবৃত্তি হয়েছিল।
লেবেলিং সাইটের জৈব রাসায়নিক যাচাইকরণের জন্য, ভর স্পেকট্রোমেট্রি দ্বারা চিহ্নিত PRDX3 এবং PRDX1 হিস্টিডিন থেকে অ্যালানিনে পরিবর্তিত হয়েছিল এবং ট্রান্সফেকশন অ্যাসেসের বন্য প্রকারের সাথে তুলনা করা হয়েছিল।PDPL ফলাফল দেখিয়েছে যে মিউটেশন উল্লেখযোগ্যভাবে লেবেলিং হ্রাস করেছে (চিত্র 2d)।এদিকে, খোলা অনুসন্ধানে চিহ্নিত পেপটাইড সিকোয়েন্সগুলি প্রোব 3 এবং নীল আলোর উপস্থিতিতে বিশুদ্ধ মিনিএসওজি দিয়ে ভিট্রোতে সংশ্লেষিত এবং বিক্রিয়া করা হয়েছিল, এলসি-এমএস দ্বারা শনাক্ত করার সময় +247 এবং +229 Da-এর ভর পরিবর্তনের সাথে পণ্যগুলি উত্পাদন করে (চিত্র 2ই)।)মিনিএসওজি ফটোঅ্যাক্টিভেশনের প্রতিক্রিয়ায় প্রক্সিমাল প্রোটিনগুলিকে ভিট্রোতে লেবেল করা যেতে পারে কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য, আমরা miniSOG-6xHis প্রোটিন এবং ভিট্রোতে একটি অ্যান্টি-হিস মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডির মধ্যে মিথস্ক্রিয়া দ্বারা একটি কৃত্রিম প্রক্সিমিটি অ্যাস ডিজাইন করেছি (চিত্র 2f)।এই পরীক্ষায়, আমরা মিনিএসওজি সহ অ্যান্টিবডি ভারী এবং হালকা চেইনের প্রক্সিমাল লেবেলিংয়ের প্রত্যাশা করেছি।প্রকৃতপক্ষে, অ্যান্টি-মাউস (এন্টি-6xHis-লেবেলযুক্ত অ্যান্টিবডির ভারী এবং হালকা চেইনগুলিকে স্বীকৃতি দেওয়া) এবং স্ট্রেপ্টাভিডিন ওয়েস্টার্ন ব্লটগুলি ভারী এবং হালকা চেইনের শক্তিশালী বায়োটিনিলেশন দেখিয়েছে।উল্লেখযোগ্যভাবে, আমরা 6xHis ট্যাগ এবং হালকা এবং ভারী চেইনের মধ্যে ক্রস-লিঙ্কগুলির কারণে miniSOG অটোবায়োটিনাইলেশন লক্ষ্য করেছি, যা লাইসিন এবং 2-অক্সো-হিস্টিডিন প্রক্সিমাল প্রতিক্রিয়ার মধ্যে পূর্বে বর্ণিত ব্যবধানের সাথে সম্পর্কিত হতে পারে।উপসংহারে, আমরা উপসংহারে পৌঁছেছি যে PDPL একটি প্রক্সিমিটি নির্ভর পদ্ধতিতে হিস্টিডিনকে সংশোধন করে।
আমাদের পরবর্তী লক্ষ্য ছিল সিটু লেবেলিংয়ের নির্দিষ্টতা পরীক্ষা করার জন্য উপকোষীয় প্রোটিওমকে বৈশিষ্ট্যযুক্ত করা।অতএব, আমরা স্থিরভাবে নিউক্লিয়াস, মাইটোকন্ড্রিয়াল ম্যাট্রিক্স, বা HEK293T কোষের বাইরের ER মেমব্রেনে miniSOG প্রকাশ করেছি (চিত্র 3a)।জেল ফ্লুরোসেন্স বিশ্লেষণ তিনটি সাবসেলুলার অবস্থানে প্রচুর লেবেলযুক্ত ব্যান্ডের পাশাপাশি বিভিন্ন লেবেলিং প্যাটার্ন (চিত্র 3b) প্রকাশ করেছে।ফ্লুরোসেন্স ইমেজিং বিশ্লেষণে PDPL (চিত্র 3c) এর উচ্চ নির্দিষ্টতা দেখানো হয়েছে।পিডিপিএল ওয়ার্কফ্লো ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি ব্যবহার করে সাবসেলুলার প্রোটিওমগুলিকে চিত্রিত করার জন্য রোডামাইন রঞ্জকগুলির সাথে ক্লিক প্রতিক্রিয়া দ্বারা অনুসরণ করা হয়েছিল এবং PDPL সংকেতগুলিকে DAPI, মাইটোকন্ড্রিয়াল ট্র্যাকার বা ER ট্র্যাকারগুলির সাথে একত্রিত করা হয়েছিল, যা PDPL-এর উচ্চ বিশ্বস্ততা নিশ্চিত করে।তিনটি অর্গানেল অবস্থানের জন্য, এভিডিন ওয়েস্টার্ন ব্লট ব্যবহার করে টার্বোআইডির সাথে পিডিপিএল-এর পাশাপাশি তুলনা করে দেখা গেছে যে পিডিপিএলকে তাদের নিজ নিজ নিয়ন্ত্রণের তুলনায় আরও নির্দিষ্টভাবে লেবেল করা হয়েছিল।PDPL অবস্থার অধীনে, আরও লেবেলযুক্ত ব্যান্ডগুলি উপস্থিত হয়েছিল, যা আরও পিডিপিএল-লেবেলযুক্ত প্রোটিন নির্দেশ করে (পরিপূরক চিত্র 6a-d)।
মিনিএসওজি-মধ্যস্থিত অর্গানেল-নির্দিষ্ট প্রোটিওম লেবেলিংয়ের একটি পরিকল্পিত উপস্থাপনা।miniSOG ফিউশনের মাধ্যমে মাইটোকন্ড্রিয়াল ম্যাট্রিক্সকে লক্ষ্য করে মানব COX4 (mito-miniSOG) এর N-টার্মিনাল 23 অ্যামিনো অ্যাসিড, নিউক্লিয়াস থেকে ফিউশনের মাধ্যমে H2B (নিউক্লিয়াস-মিনিএসওজি), এবং ER মেমব্রেনের সাইটোপ্লাজমিক সাইডের মাধ্যমে Sec61β (ER-miniSOG)। )ইঙ্গিতগুলির মধ্যে রয়েছে জেল ইমেজিং, কনফোকাল ইমেজিং এবং ভর স্পেকট্রোমেট্রি।b তিনটি অর্গানেল-নির্দিষ্ট PDPL প্রোফাইলের প্রতিনিধি জেল চিত্র।CBB Coomassie ব্রিলিয়ান্ট ব্লু।c HEK293T কোষের প্রতিনিধি কনফোকাল চিত্রগুলি V5 (লাল) লেবেলযুক্ত অ্যান্টিবডি দ্বারা সনাক্ত করা বিভিন্ন উপকোষীয় স্থানীয়করণের সাথে মিনিএসওজিকে স্থিরভাবে প্রকাশ করে।মাইটোকন্ড্রিয়া এবং ইআর (সবুজ) এর জন্য উপকোষীয় মার্কার ব্যবহার করা হয়।PDPL কর্মপ্রবাহে Cy3-azide ক্লিক রসায়ন ব্যবহার করে miniSOG (হলুদ) লেবেলযুক্ত সাবসেলুলার প্রোটিওম সনাক্তকরণ অন্তর্ভুক্ত রয়েছে।স্কেল বার: 10 µm।d বিভিন্ন অর্গানেলে পিডিপিএল-ট্যাগযুক্ত প্রোটিওমের আগ্নেয়গিরির প্লটগুলি লেবেলবিহীন পরিমাপ দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছে (n = 3 স্বাধীন জৈবিক পরীক্ষা)।আগ্নেয়গিরির প্লটে টু-টেইলড স্টুডেন্টস টি-টেস্ট ব্যবহার করা হয়েছিল।HEK293T বন্য প্রকার একটি নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত প্রোটিনগুলি লাল রঙে হাইলাইট করা হয়েছে (p <0.05 এবং> 2-গুণ আয়ন তীব্রতার পার্থক্য)। উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত প্রোটিনগুলি লাল রঙে হাইলাইট করা হয়েছে (p <0.05 এবং> 2-গুণ আয়ন তীব্রতার পার্থক্য)। Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов)। উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত প্রোটিনগুলি লাল রঙে হাইলাইট করা হয়েছে (p <0.05 এবং আয়নের তীব্রতায় 2-গুণ পার্থক্য)।显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）।显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和>2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе)। উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত প্রোটিনগুলি লাল রঙে হাইলাইট করা হয়েছে (p <0.05 এবং> আয়নিক শক্তিতে 2-গুণ পার্থক্য)।HEK293T-miniSOG-এর জন্য গুরুত্বপূর্ণ সম্পর্কিত প্রোটিনগুলি কিন্তু HEK293T-এর জন্য গুরুত্বপূর্ণ নয় সবুজ রঙে দেখানো হয়েছে।e পরীক্ষাগুলি থেকে প্রোটিওমিক ডেটাসেটের নির্দিষ্টতার বিশ্লেষণ ঘ.প্রতিটি অর্গানেলে (লাল এবং সবুজ বিন্দু) পরিসংখ্যানগতভাবে উল্লেখযোগ্য প্রোটিনের মোট সংখ্যা শীর্ষে চিহ্নিত করা হয়েছে।হিস্টোগ্রামগুলি MitoCarta 3.0, GO বিশ্লেষণ এবং A. Ting et al-এর উপর ভিত্তি করে অর্গানেলগুলিতে প্রোটিন স্থানীয়করণ দেখায়।মানুষমাইটোকন্ড্রিয়া, নিউক্লিয়াস এবং ER এর জন্য পৃথক ডেটাসেট।এই পরীক্ষাগুলি স্বতন্ত্রভাবে অনুরূপ ফলাফলের সাথে কমপক্ষে দুবার পুনরাবৃত্তি হয়েছিল।কাঁচা তথ্য কাঁচা ডেটা ফাইল আকারে প্রদান করা হয়.
জেল এবং ইমেজিং ফলাফল দ্বারা উত্সাহিত, প্রতিটি অর্গানেল (পরিপূরক ডেটা 2) এ চিহ্নিত প্রোটিওম পরিমাপ করতে লেবেল-মুক্ত পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছিল।অপরিবর্তিত HEK293T ব্যাকগ্রাউন্ড মার্কার বিয়োগ করার জন্য নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। আগ্নেয়গিরির প্লট বিশ্লেষণে উল্লেখযোগ্যভাবে সমৃদ্ধ প্রোটিন (p <0.05 এবং >2-গুণ আয়ন তীব্রতা) এবং সেইসাথে সিঙ্গলটন প্রোটিনগুলি প্রদর্শিত হয়েছে যা শুধুমাত্র মিনিএসওজি-প্রকাশকারী লাইনে (চিত্র 3d লাল এবং সবুজ বিন্দু) উপস্থিত রয়েছে। আগ্নেয়গিরির প্লট বিশ্লেষণে উল্লেখযোগ্যভাবে সমৃদ্ধ প্রোটিন (p <0.05 এবং >2-গুণ আয়ন তীব্রতা) এবং সেইসাথে সিঙ্গলটন প্রোটিনগুলি প্রদর্শিত হয়েছে যা শুধুমাত্র মিনিএসওজি-প্রকাশকারী লাইনে (চিত্র 3d লাল এবং সবুজ বিন্দু) উপস্থিত রয়েছে। Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). আগ্নেয়গিরির প্লট বিশ্লেষণে উল্লেখযোগ্যভাবে সমৃদ্ধ প্রোটিন (p<0.05 এবং >2-গুণ আয়ন তীব্রতা) পাশাপাশি একক প্রোটিন দেখানো হয়েছে যা শুধুমাত্র মিনিএসওজি-প্রকাশকারী লাইনে (চিত্র 3d, লাল এবং সবুজ বিন্দু) উপস্থিত রয়েছে।火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 蛋白质 （পি <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 以及 仅 存 存 মিনিসোগ 表达 系 系 的 单一 蛋白质 （图 3 ডি 红色 红色 和 绿色点 绿色点 绿色点 绿色点 绿色点 绿色点 绿色点 绿色点）））））））））））））））火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （পি <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 মিনিসোগ 表达 系 的 的 蛋白质 （图 图）））））））））））））））））））））））））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). আগ্নেয়গিরির প্লট বিশ্লেষণে উল্লেখযোগ্যভাবে সমৃদ্ধ প্রোটিন (p<0.05 এবং >2x আয়নিক শক্তি) এবং সেইসাথে শুধুমাত্র মিনিএসওজি এক্সপ্রেশন লাইনে উপস্থিত একক প্রোটিন (চিত্র 3d-এ লাল এবং সবুজ বিন্দু) প্রকাশিত হয়েছে।এই তথ্যগুলিকে একত্রিত করে, আমরা যথাক্রমে 1364, 461, এবং 911 পরিসংখ্যানগতভাবে উল্লেখযোগ্য পারমাণবিক, মাইটোকন্ড্রিয়াল এবং ER বাইরের ঝিল্লি প্রোটিন চিহ্নিত করেছি।অর্গানেল-স্থানীয় PDPL-এর যথার্থতা বিশ্লেষণ করতে, আমরা MitoCarta 3.0, জিন অন্টোলজি (GO) বিশ্লেষণ এবং A. Ting et al ব্যবহার করেছি।73.4, 78.5 এবং 73.0% (চিত্র 3e) এর নির্ভুলতার সাথে সঙ্গতিপূর্ণ, সনাক্ত করা প্রোটিনের অর্গানেল নির্দিষ্টতা পরীক্ষা করতে মাইটোকন্ড্রিয়া, নিউক্লিয়াস এবং ER-এর জন্য একটি ডেটা সেট8 ব্যবহার করা হয়েছিল।PDPL এর নির্দিষ্টতা নিশ্চিত করে যে PDPL অর্গানেল-নির্দিষ্ট প্রোটিওম সনাক্ত করার জন্য একটি আদর্শ হাতিয়ার।উল্লেখযোগ্যভাবে, চিহ্নিত মাইটোকন্ড্রিয়াল প্রোটিনের সাবমিটোকন্ড্রিয়াল বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে আটকা পড়া প্রোটিওম প্রধানত ম্যাট্রিক্স এবং অভ্যন্তরীণ ঝিল্লিতে (যথাক্রমে 226 এবং 106) বিতরণ করা হয়েছিল, চিহ্নিত মাইটোকন্ড্রিয়াল প্রোটিনের মোট সংখ্যার 91.7% (362) জন্য অ্যাকাউন্টিং।একটি উচ্চ স্তরের PDPL অতিরিক্তভাবে নিশ্চিত করা হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 7a)।একইভাবে, সাবনিউক্লিয়ার বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে ক্যাপচার করা প্রোটিওম প্রধানত নিউক্লিয়াস, নিউক্লিওপ্লাজম এবং নিউক্লিওলাসে (পরিপূরক চিত্র 7b) বিতরণ করা হয়েছিল।পারমাণবিক স্থানীয়করণ সংকেত পেপটাইড (3xNLS) সহ পারমাণবিক প্রোটিওমিক বিশ্লেষণ H2B গঠনের অনুরূপ নির্ভুলতা দেখিয়েছে (পরিপূরক চিত্র 7c–h)।PDPL মার্কারের নির্দিষ্টতা নির্ধারণের জন্য, পারমাণবিক ল্যামিনিন A কে আরও বিচ্ছিন্নভাবে স্থানীয় POI7 ফাঁদ হিসাবে বেছে নেওয়া হয়েছিল।PDPL 36টি উল্লেখযোগ্যভাবে সমৃদ্ধ প্রোটিন শনাক্ত করেছে, যার মধ্যে 12টি প্রোটিন (30.0% ল্যামিন A সহ) স্ট্রিং ডাটাবেস দ্বারা টীকাকৃত ভাল বৈশিষ্ট্যযুক্ত ল্যামিন A ইন্টারেক্টিং প্রোটিন, যা 28-এর 28-এর মধ্যে BioID পদ্ধতির (122 প্রোটিন) তুলনায় উচ্চ শতাংশের সাথে। , 22.9 %) 7. আমাদের পদ্ধতি কম প্রোটিন চিহ্নিত করেছে, সম্ভবত সীমিত লেবেলিং এলাকার কারণে, যা আরও সক্রিয় সিঙ্গেল অক্সিজেন দ্বারা সম্ভব হয়েছে।জিও বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে চিহ্নিত প্রোটিনগুলি মূলত নিউক্লিওপ্লাজম (26), নিউক্লিয়ার মেমব্রেন (10), নিউক্লিয়ার মেমব্রেন (9) এবং নিউক্লিয়ার ছিদ্রে (5) অবস্থিত।সমষ্টিগতভাবে, এই পারমাণবিক-স্থানীয় প্রোটিনগুলি সমৃদ্ধ প্রোটিনের 80% জন্য দায়ী, আরও PDPL এর নির্দিষ্টতা প্রদর্শন করে (পরিপূরক চিত্র 8a–d)।
অর্গানেলগুলিতে প্রক্সিমিটি মার্কিং করার জন্য PDPL-এর ক্ষমতা প্রতিষ্ঠিত করার পরে, আমরা পরীক্ষা করেছিলাম যে PDPL POI বাইন্ডিং অংশীদারদের বিশ্লেষণ করতে ব্যবহার করা যেতে পারে কিনা।বিশেষত, আমরা সাইটোসোলিক প্রোটিনগুলির পিডিপিএল বিশ্লেষণকে সংজ্ঞায়িত করার চেষ্টা করেছি, যা তাদের অত্যন্ত গতিশীল প্রকৃতির কারণে তাদের ঝিল্লি-স্থানীয় সমকক্ষের তুলনায় আরও কঠিন লক্ষ্য হিসাবে বিবেচিত হয়।ব্রোমোডোমেন এবং এক্সট্রাটার্মিনাল (বিইটি) প্রোটিন BRD4 বিভিন্ন রোগে এর মূল ভূমিকার জন্য আমাদের দৃষ্টি আকর্ষণ করেছে 35, 36।BRD4 দ্বারা গঠিত কমপ্লেক্স একটি ট্রান্সক্রিপশনাল কোঅ্যাক্টিভেটর এবং একটি গুরুত্বপূর্ণ থেরাপিউটিক লক্ষ্য।c-myc এবং Wnt5a ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টরগুলির অভিব্যক্তি নিয়ন্ত্রণ করে, BRD4 কে তীব্র মাইলয়েড লিউকেমিয়া (AML), মাল্টিপল মাইলোমা, বার্কিট'স লিম্ফোমা, কোলন ক্যান্সার এবং প্রদাহজনিত রোগের মূল নির্ধারক বলে মনে করা হয়।এছাড়াও, কিছু ভাইরাস ভাইরাল এবং সেলুলার ট্রান্সক্রিপশন নিয়ন্ত্রণ করতে BRD4 কে লক্ষ্য করে, যেমন প্যাপিলোমাভাইরাস, HIV এবং SARS-CoV-236,39।
PDPL ব্যবহার করে BRD4 মিথস্ক্রিয়া ম্যাপ করতে, আমরা BRD4 এর একটি ছোট N- বা C-টার্মিনাল আইসোফর্মের সাথে miniSOG একত্রিত করেছি।প্রোটোমিক ফলাফল দুটি নির্মাণের মধ্যে উচ্চ মাত্রার ওভারল্যাপ প্রকাশ করেছে (পরিপূরক চিত্র 9a)।miniSOG-H2B দ্বারা চিহ্নিত পারমাণবিক প্রোটিওম BRD4 এর সাথে মিথস্ক্রিয়াকারী প্রোটিনের 77.6% কভার করে (পরিপূরক চিত্র 9b)।তারপরে, আলোকসজ্জার বিভিন্ন সময় (2, 5, 10, 20 মিনিট) মার্কার ব্যাসার্ধ সামঞ্জস্য করতে ব্যবহার করা হয়েছিল (চিত্র 4a এবং পরিপূরক ডেটা 3)।আমরা উপসংহারে পৌঁছেছি যে সংক্ষিপ্ত ফটোপিরিয়ডগুলিতে, PDPL প্রাথমিকভাবে সরাসরি বাঁধাই অংশীদারদের লেবেল করবে, যখন দীর্ঘ সময়ের মধ্যে ছোট ফটোঅ্যাক্টিভেশন সময়কালে চিহ্নিত প্রোটিনগুলির পাশাপাশি লেবেলিং কমপ্লেক্সগুলিতে পরোক্ষ লক্ষ্যগুলি অন্তর্ভুক্ত থাকবে।প্রকৃতপক্ষে, আমরা সন্নিহিত সময় বিন্দুগুলির মধ্যে শক্তিশালী ওভারল্যাপ পেয়েছি (2 এবং 5 মিনিটের জন্য 84.6%; 5 এবং 10 মিনিটের জন্য 87.7%; 10 এবং 20 মিনিটের জন্য 98.7%) (চিত্র 4b এবং পরিপূরক চিত্র 9c)।সমস্ত পরীক্ষামূলক গোষ্ঠীতে, আমরা শুধুমাত্র BRD4 স্ব-লেবেলিং খুঁজে পাইনি, কিন্তু স্ট্রিং ডাটাবেসে টীকাযুক্ত MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, এবং HMGB1 এর মতো বেশ কয়েকটি পরিচিত লক্ষ্যমাত্রা খুঁজে পেয়েছি।এই লক্ষ্যগুলির আয়নিক শক্তি এক্সপোজার সময়ের সমানুপাতিক (চিত্র 4c এবং পরিপূরক চিত্র 9d)।2-মিনিটের গ্রুপে চিহ্নিত প্রোটিনগুলির GO বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে চিহ্নিত প্রোটিনগুলি নিউক্লিয়াসে স্থানীয়করণ করা হয়েছিল এবং ক্রোমাটিন রিমডেলিং এবং আরএনএ পলিমারেজ ফাংশনে জড়িত ছিল।প্রোটিনের আণবিক ফাংশন ক্রোমাটিন বাইন্ডিং বা ট্রান্সক্রিপশনাল কোঅ্যাক্টিভেশনে সমৃদ্ধ হয়েছিল, BRD4 ফাংশনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ (চিত্র 4d)।স্ট্রিং ডাটাবেস-সক্ষম প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া বিশ্লেষণ BRD4 এবং HDAC পরিবারের ইন্টারঅ্যাকশন কমপ্লেক্স যেমন SIN3A, NCOR2, BCOR, এবং SAP130 (চিত্র 4e এবং পরিপূরক চিত্র 9e) মধ্যে পরোক্ষ মিথস্ক্রিয়াগুলির প্রথম স্তর প্রকাশ করেছে, BRD4 এবং HDAC বাইন্ডিং অ্যাসিটিলেটেড তার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। ..উপরন্তু, Sin3A, NSUN2, Fus, এবং SFPQ সহ LC-MS/MS দ্বারা চিহ্নিত প্রতিনিধি লক্ষ্যগুলি ওয়েস্টার্ন ব্লটিং (চিত্র 4f) দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছে।সম্প্রতি, BRD4 এর সংক্ষিপ্ত আইসোফর্ম তরল-তরল ফেজ বিভাজন (LLPS) বৈশিষ্ট্য সহ নিউক্লিয়াস গঠন করে বলে জানা গেছে।RNA বাইন্ডিং প্রোটিন Fus এবং SFPQ বিভিন্ন সেলুলার প্রসেসের LLPS-এর মধ্যস্থতা করে এবং এখানে অলিখিত BRD4 বাইন্ডিং প্রোটিন হিসাবে চিহ্নিত করা হয়েছে।BRD4 এবং SFPQ-এর মধ্যে মিথস্ক্রিয়াটি সহ-ইমিউনোপ্রেসিপিটেশন (কো-আইপি) পরীক্ষা (চিত্র 4g) দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছিল, যা আরও তদন্তের যোগ্য BRD4-মধ্যস্থ তরল-তরল পর্যায় বিভাজনের জন্য আরেকটি প্রক্রিয়ার পরামর্শ দেয়।একসাথে নেওয়া, এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে PDPL পরিচিত BRD4 ইন্টারঅ্যাকটিং এবং অজানা বাঁধাই প্রোটিন সনাক্ত করার জন্য একটি আদর্শ প্ল্যাটফর্ম।
মিনিএসওজি-মধ্যস্থ BRD4 প্রক্সিমিটি মার্কিং, এক্সপোজার সময়: 2, 5, 10, এবং 20 মিনিটের একটি পরিকল্পিত উপস্থাপনা।b বিভিন্ন আলোকসজ্জার সময়ে চিহ্নিত প্রোটিনের ওভারল্যাপ।HEK293T-miniSOG-BRD4 তে চিহ্নিত প্রোটিন সমৃদ্ধকরণ বন্য-টাইপ HEK293T এর তুলনায় পরিসংখ্যানগতভাবে উল্লেখযোগ্য ছিল।গ নির্দিষ্ট এক্সপোজার সময়ের মধ্যে লেবেলবিহীন প্রতিনিধি পরিচিত BRD4-বাইন্ডিং প্রোটিন পরিমাপ করার সময় আয়নের তীব্রতা।n = 3টি জৈবিকভাবে স্বাধীন নমুনা।ডেটা গড় ± স্ট্যান্ডার্ড বিচ্যুতি হিসাবে উপস্থাপন করা হয়।2-মিনিটের গ্রুপে চিহ্নিত প্রোটিনের জিন অন্টোলজিকাল বিশ্লেষণ (GO)।প্রথম দশটি জিও পদ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে।বুদবুদগুলি GO শব্দের বিভাগ অনুসারে রঙিন হয় এবং বুদবুদের আকার প্রতিটি পদে পাওয়া প্রোটিনের সংখ্যার সমানুপাতিক।e BRD4 এর সাথে মিথস্ক্রিয়াকারী প্রোটিনের স্ট্রিং বিশ্লেষণ।হলুদ বৃত্ত হল সরাসরি আঠালো এবং ধূসর বৃত্ত হল পরোক্ষ আঠার প্রথম স্তর।লাল রেখাগুলি পরীক্ষামূলকভাবে নির্ধারিত মিথস্ক্রিয়াগুলির প্রতিনিধিত্ব করে এবং নীল রেখাগুলি পূর্বাভাসিত মিথস্ক্রিয়াগুলির প্রতিনিধিত্ব করে।f LC-MS/MS-এ চিহ্নিত প্রতিনিধি BRD4 বাঁধাই লক্ষ্যগুলি পশ্চিমী ব্লটিং দ্বারা যাচাই করা হয়েছিল।জি কো-ইমিউনোপ্রেসিপিটেশন পরীক্ষাগুলি SFPQ এবং BRD4 এর মধ্যে মিথস্ক্রিয়া নিশ্চিত করে।এই পরীক্ষাগুলি স্বতন্ত্রভাবে অনুরূপ ফলাফলের সাথে কমপক্ষে দুবার পুনরাবৃত্তি হয়েছিল।কাঁচা তথ্য কাঁচা ডেটা ফাইল আকারে প্রদান করা হয়.
অনিবন্ধিত POI-সংশ্লিষ্ট লক্ষ্যগুলি চিহ্নিত করার পাশাপাশি, আমরা অনুমান করি যে PDPL এনজাইমের জন্য সাবস্ট্রেটগুলি সনাক্ত করার জন্য উপযুক্ত হবে, যার জন্য অনিবন্ধিত সাবস্ট্রেটগুলিকে টীকা দেওয়ার জন্য বড় কমপ্লেক্সে পরোক্ষ বাঁধাই প্রোটিনের বৈশিষ্ট্য প্রয়োজন হবে।পারকিন (PARK2 দ্বারা এনকোড করা) হল একটি E3 ligase এবং পার্কিনের মিউটেশনগুলি অটোসোমাল রিসেসিভ জুভেনাইল পারকিনসন্স ডিজিজ (AR-JP)42 এর কারণ হিসাবে পরিচিত।উপরন্তু, পার্কিনকে মাইটোফ্যাজি (মাইটোকন্ড্রিয়াল অটোফ্যাজি) এবং প্রতিক্রিয়াশীল অক্সিজেন প্রজাতির অপসারণের জন্য অপরিহার্য হিসাবে বর্ণনা করা হয়েছে।যাইহোক, যদিও বেশ কয়েকটি পার্কিন সাবস্ট্রেট সনাক্ত করা হয়েছে, এই রোগে পার্কিনের ভূমিকা এখনও অস্পষ্ট।এর অচ্যুতিত সাবস্ট্রেটগুলিকে টীকা দেওয়ার জন্য, পার্কিনের N- বা C-টার্মিনাসে miniSOG যোগ করে PDPL পরীক্ষা করা হয়েছিল।PINK1-পার্কিন পাথওয়ের মাধ্যমে পার্কিন সক্রিয় করতে কোষগুলিকে কার্বনাইল সায়ানাইড প্রোটন ট্রান্সপোর্টার এম-ক্লোরোফেনাইলহাইড্রাজোন (সিসিপি) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল।আমাদের BRD4 PDPL ফলাফলের তুলনায়, পার্কিন এন-টার্মিনাস ফিউশন লক্ষ্য প্রোটিনের একটি বৃহত্তর সেট প্রকাশ করেছে, যদিও এটি সি-টার্মিনাসের একটি বৃহত্তর অংশ কভার করেছে (210 এর মধ্যে 177টি) (চিত্র 5a,b এবং পরিপূরক ডেটা 4)।ফলাফলটি রিপোর্টের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ যে এন-টার্মিনাল ট্যাগগুলি পার্কিন44 সক্রিয় করতে পারে।আশ্চর্যজনকভাবে, Parkin43 এর জন্য প্রকাশিত AP-MS ফলাফল সহ আমাদের ডেটাতে শুধুমাত্র 18টি ওভারল্যাপিং প্রোটিন ছিল, সম্ভবত সেল লাইন এবং প্রোটিওমিক্স ওয়ার্কফ্লোগুলির মধ্যে পার্থক্যের কারণে।চারটি পরিচিত প্রোটিন ছাড়াও (ARDM1, HSPA8, PSMD14, এবং PSMC3) দুটি পদ্ধতি দ্বারা চিহ্নিত (চিত্র 5c)43।LC-MS/MS-এর ফলাফল আরও যাচাই করার জন্য, PDPL চিকিত্সা এবং পরবর্তী ওয়েস্টার্ন ব্লটিং ব্যবহার করা হয়েছিল HEK293T প্যারেন্ট সেল অ্যাস এবং স্থিতিশীল এন-টার্মিনাল পার্কিন লাইনের ফলাফলের তুলনা করতে।পূর্বে অজানা লক্ষ্য CDK2, DUT, CTBP1, এবং PSMC4 একটি পরিচিত বাইন্ডার, DNAJB1 (চিত্র 5d) দিয়ে পরীক্ষা করা হয়েছিল।
HEK293T কোষে পার্কিন-ইন্টার্যাক্টিং প্রোটিনের আগ্নেয়গিরির প্লট পার্কিনের N- বা C-টার্মিনাসের সাথে স্থিরভাবে প্রকাশ করা মিনিএসওজি (n = 3 স্বাধীন জৈবিক পরীক্ষা)।আগ্নেয়গিরির প্লটে টু-টেইলড স্টুডেন্টস টি-টেস্ট ব্যবহার করা হয়েছিল।HEK293T একটি নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত প্রোটিনগুলি লাল রঙে হাইলাইট করা হয়েছে (p <0.05 এবং> 2-গুণ আয়ন তীব্রতার পার্থক্য)। উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত প্রোটিনগুলি লাল রঙে হাইলাইট করা হয়েছে (p <0.05 এবং> 2-গুণ আয়ন তীব্রতার পার্থক্য)। Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов)। উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত প্রোটিনগুলি লাল রঙে হাইলাইট করা হয়েছে (p <0.05 এবং আয়নের তীব্রতায় 2-গুণ পার্থক্য)।显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）।显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和>2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе)। উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত প্রোটিনগুলি লাল রঙে হাইলাইট করা হয়েছে (p <0.05 এবং> আয়নিক শক্তিতে 2-গুণ পার্থক্য)।HEK293T-miniSOG-এর জন্য গুরুত্বপূর্ণ সম্পর্কিত প্রোটিনগুলি কিন্তু HEK293T-এর জন্য গুরুত্বপূর্ণ নয় সবুজ রঙে দেখানো হয়েছে।b ভেন ডায়াগ্রাম এন-টার্মিনাল এবং সি-টার্মিনাল গঠনের মধ্যে ওভারল্যাপিং প্রোটিন দেখাচ্ছে।এন-টার্মিনাল ট্যাগগুলি অযৌক্তিকভাবে পার্কিনকে সক্রিয় করতে পারে এবং এর ফলে আরও শনাক্তযোগ্য প্রোটিন তৈরি হয়।c ভেন ডায়াগ্রাম PDPL এবং AP-MS-এর মধ্যে ওভারল্যাপিং প্রোটিন দেখাচ্ছে।পরিচিত ইন্টারঅ্যাক্টর তালিকাভুক্ত করা হয়েছে, যার মধ্যে 18টি ওভারল্যাপিং প্রোটিন এবং 159টির মধ্যে 11টি বিশেষভাবে PDPL-তে চিহ্নিত করা হয়েছে।d এলসি-এমএস/এমএস দ্বারা চিহ্নিত প্রতিনিধি লক্ষ্যগুলি পশ্চিমা ব্লটিং দ্বারা যাচাই করা হয়েছিল।e Ssu72 এবং SNW1 কে অনিবন্ধিত পার্কিন সাবস্ট্রেট হিসাবে চিহ্নিত করা হয়েছিল।এই ফ্ল্যাগ-ট্যাগযুক্ত প্রোটিন প্লাজমিডগুলি HEK293T এবং HEK293T-পার্কিন-মিনিএসওজি-তে স্থানান্তরিত হয়েছিল এবং তারপরে বিভিন্ন সময় পয়েন্টে CCCP চিকিত্সা করা হয়েছিল।পারকিন ওভার এক্সপ্রেশন লাইনে অবনতি আরও প্রকট ছিল।f প্রোটিসোম ইনহিবিটর MG132 ব্যবহার করে, এটি নিশ্চিত করা হয়েছিল যে Ssu72 এবং SNW1 এর অবক্ষয় প্রক্রিয়া প্রোটিসোম-সর্বজনীনতা দ্বারা মধ্যস্থতা করা হয়েছে।এই পরীক্ষাগুলি স্বতন্ত্রভাবে অনুরূপ ফলাফলের সাথে কমপক্ষে দুবার পুনরাবৃত্তি হয়েছিল।কাঁচা তথ্য কাঁচা ডেটা ফাইল আকারে প্রদান করা হয়.
উল্লেখযোগ্যভাবে, পিডিপিএল দ্বারা চিহ্নিত প্রোটিনগুলিতে অবশ্যই পার্কিন-বাইন্ডিং প্রোটিন এবং তাদের স্তর অন্তর্ভুক্ত থাকতে হবে।অনিবন্ধিত পার্কিন সাবস্ট্রেটগুলি সনাক্ত করতে, আমরা সাতটি চিহ্নিত প্রোটিন (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 এবং SNW1) এবং স্থানান্তরিত প্লাজমিডগুলিকে এই জিনগুলিকে স্বাভাবিক HEK293T-তে প্রকাশ করার জন্য এবং স্থিরভাবে মিনিএসওজি-পার্কিন'স-পার্কিন'স 2 সিসিপিএইচই 2 সিসিপিএইচই 2 সিসিপি 93 টি চিকিত্সার মাধ্যমে প্রকাশ করার জন্য নির্বাচন করেছি।Ssu72 এবং SNW1 প্রোটিনের মাত্রা স্থিতিশীল মিনিএসওজি-পার্কিন লাইনে (চিত্র 5e) উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে।12 ঘন্টার জন্য CCCP এর সাথে চিকিত্সার ফলে উভয় স্তরের সবচেয়ে উল্লেখযোগ্য অবনতি ঘটে।Ssu72 এবং SNW1 এর অবক্ষয় প্রোটিসোম-ইউবিকিউটিনেশন দ্বারা নিয়ন্ত্রিত কিনা তা তদন্ত করার জন্য, প্রোটিসোম ক্রিয়াকলাপকে বাধা দেওয়ার জন্য প্রোটিসোম ইনহিবিটর MG132 যুক্ত করা হয়েছিল এবং আসলে আমরা দেখতে পেয়েছি যে তাদের অবক্ষয় প্রক্রিয়া বাধাগ্রস্ত হয়েছিল (চিত্র 5f)।অতিরিক্ত নন-সাবস্ট্রেট লক্ষ্যগুলি ওয়েস্টার্ন ব্লটিং (পরিপূরক চিত্র 10) ব্যবহার করে পারকিন ইন্টারঅ্যাক্টর হিসাবে নিশ্চিত করা হয়েছিল, যা LC-MS/MS-এর সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ ফলাফল দেখায়।উপসংহারে, লক্ষ্য প্রোটিন স্থানান্তর যাচাইকরণের সাথে PDPL কর্মপ্রবাহের সংহতকরণ অনিবন্ধিত E3 ligase সাবস্ট্রেট সনাক্তকরণের অনুমতি দেয়।
আমরা একটি সাধারণ প্রক্সিমিটি মার্কিং প্ল্যাটফর্ম তৈরি করেছি যা আপনাকে স্থান এবং সময় ইন্টারঅ্যাক্টিং POI সনাক্ত করতে দেয়।প্ল্যাটফর্মটি মিনিএসওজি ফটোসেনসিটাইজার প্রোটিনের উপর ভিত্তি করে তৈরি, যা প্রায় 12 কেডিএ, পরিপক্ক APEX2 এনজাইমের (27 কেডিএ) আকারের অর্ধেকেরও কম এবং TurboID (35 কেডিএ) আকারের এক তৃতীয়াংশ।ছোট আকারের ছোট প্রোটিন ইন্টারঅ্যাটোম অধ্যয়ন করার জন্য অ্যাপ্লিকেশনের পরিসীমা ব্যাপকভাবে প্রসারিত করা উচিত।সিঙ্গলেট অক্সিজেনের কোয়ান্টাম ফলন বাড়ানো এবং এই পদ্ধতির সংবেদনশীলতা প্রসারিত করার জন্য অতিরিক্ত ফটোসেনসিটাইজারগুলির আরও অনুসন্ধান, জেনেটিকালি এনকোডেড প্রোটিন বা ছোট অণু যাই হোক না কেন, প্রয়োজন।মিনিএসওজি-এর বর্তমান সংস্করণের জন্য, প্রক্সিমিটি মার্কারগুলি সক্রিয় করতে নীল আলোকসজ্জা ব্যবহার করে উচ্চ অস্থায়ী রেজোলিউশন অর্জন করা যেতে পারে।উপরন্তু, দীর্ঘ এক্সপোজার সময় একক অক্সিজেনের একটি বৃহত্তর "মেঘ" প্রকাশ করে, যার ফলে আরও দূরবর্তী হিস্টিডিন অবশিষ্টাংশের পরিবর্তন হয়, লেবেলিং ব্যাসার্ধ বৃদ্ধি পায় এবং PDPL স্থানিক রেজোলিউশনকে সূক্ষ্ম সুর করার ক্ষমতা।আমরা সিগন্যাল-টু-ব্যাকগ্রাউন্ড অনুপাত বাড়ানোর জন্য সাতটি রাসায়নিক প্রোব পরীক্ষা করেছি এবং এই পদ্ধতির পিছনে আণবিক প্রক্রিয়াটি অন্বেষণ করেছি।TOP-ABPP কর্মপ্রবাহ নিরপেক্ষ খোলা অনুসন্ধানের সাথে মিলিত হওয়া নিশ্চিত করেছে যে পরিবর্তনগুলি শুধুমাত্র হিস্টিডাইনগুলিতে ঘটেছে এবং লুপ অঞ্চলে হিস্টিডিনগুলির জন্য একটি মাঝারি পছন্দ ব্যতীত হিস্টিডিন পরিবর্তনের জন্য কোনও সামঞ্জস্যপূর্ণ মাইক্রোএনভায়রনমেন্ট পরিলক্ষিত হয়নি।
PDPL এছাড়াও প্রোটিওম নির্দিষ্টতা এবং কভারেজ সহ সাবসেলুলার প্রোটিওমগুলিকে চিহ্নিত করতে ব্যবহার করা হয়েছে কমপক্ষে অন্যান্য প্রক্সিমিটি লেবেলিং এবং অর্গানেল-নির্দিষ্ট রাসায়নিক অনুসন্ধান পদ্ধতির সাথে তুলনীয়।প্রক্সিমিটি মার্কারগুলি পৃষ্ঠ, লাইসোসোমাল এবং সিক্রেটোম-সম্পর্কিত প্রোটিওম 46,47 চিহ্নিত করতে সফলভাবে ব্যবহার করা হয়েছে।আমরা বিশ্বাস করি যে PDPL এই উপকোষীয় অর্গানেলগুলির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ হবে।এছাড়াও, আমরা সাইটোসোলিক প্রোটিন বাইন্ডিংয়ের লক্ষ্যগুলি সনাক্ত করে পিডিপিএলকে চ্যালেঞ্জ করেছি যা তাদের গতিশীল বৈশিষ্ট্য এবং আরও অস্থায়ী মিথস্ক্রিয়ায় জড়িত থাকার কারণে ঝিল্লি আবদ্ধ প্রোটিনের চেয়ে জটিল।PDPL দুটি প্রোটিনে প্রয়োগ করা হয়েছিল, ট্রান্সক্রিপশনাল কোঅ্যাক্টিভেটর BRD4 এবং রোগ-সম্পর্কিত ligase E3 পার্কিন।এই দুটি প্রোটিন শুধুমাত্র তাদের মৌলিক জৈবিক ক্রিয়াকলাপের জন্য নয়, তাদের ক্লিনিকাল প্রাসঙ্গিকতা এবং থেরাপিউটিক সম্ভাবনার জন্যও বেছে নেওয়া হয়েছিল।এই দুটি POI-এর জন্য, সুপরিচিত বাধ্যতামূলক অংশীদারদের পাশাপাশি অনিবন্ধিত লক্ষ্যগুলি চিহ্নিত করা হয়েছিল।উল্লেখযোগ্যভাবে, ফেজ সেপারেশন-সম্পর্কিত প্রোটিন SFPQ কো-আইপি দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছিল, যা একটি নতুন প্রক্রিয়া নির্দেশ করতে পারে যার দ্বারা BRD4 (সংক্ষিপ্ত আইসোফর্ম) LLPS নিয়ন্ত্রণ করে।একই সময়ে, আমরা বিশ্বাস করি যে পারকিন সাবস্ট্রেটগুলির সনাক্তকরণ একটি দৃশ্যকল্প যেখানে পরোক্ষ আঠালো সনাক্তকরণ প্রয়োজন।আমরা দুটি অজ্ঞাত পার্কিন সাবস্ট্রেট সনাক্ত করেছি এবং সর্বব্যাপী-প্রোটিসোম পথ বরাবর তাদের অবক্ষয় নিশ্চিত করেছি।সম্প্রতি, হাইড্রোলেজ সাবস্ট্রেটগুলিকে এনজাইম দিয়ে আটকে রাখার জন্য একটি প্রক্রিয়া-ভিত্তিক ট্র্যাপিং কৌশল তৈরি করা হয়েছে।যদিও এটি একটি অত্যন্ত শক্তিশালী পদ্ধতি, এটি বৃহৎ কমপ্লেক্স গঠনের সাথে জড়িত সাবস্ট্রেটের বিশ্লেষণের জন্য উপযুক্ত নয় এবং এনজাইম এবং সাবস্ট্রেটের মধ্যে সমযোজী বন্ধন গঠনের প্রয়োজন।আমরা আশা করি যে পিডিপিএল অন্যান্য প্রোটিন কমপ্লেক্স এবং এনজাইম পরিবারগুলি যেমন ডিউবিকুইটিনেস এবং মেটালোপ্রোটেজ পরিবারগুলি অধ্যয়নের জন্য প্রসারিত করা যেতে পারে।
SOPP3 নামক miniSOG-এর একটি নতুন রূপ উন্নত সিঙ্গেল অক্সিজেন উৎপাদনের সাথে তৈরি করা হয়েছে।আমরা মিনিএসওজিকে SOPP3 এর সাথে তুলনা করেছি এবং উন্নত মার্কিং কর্মক্ষমতা খুঁজে পেয়েছি, যদিও সংকেত-থেকে-শব্দ অনুপাত অপরিবর্তিত ছিল (পরিপূরক চিত্র 11)।আমরা অনুমান করেছি যে SOPP3 এর অপ্টিমাইজেশন (যেমন, নির্দেশিত বিবর্তনের মাধ্যমে) আরও দক্ষ ফটোসেনসিটাইজার প্রোটিনের দিকে পরিচালিত করবে যার জন্য কম আলোর সময় প্রয়োজন এবং এইভাবে আরও গতিশীল সেলুলার প্রক্রিয়াগুলিকে ক্যাপচার করার অনুমতি দেয়।উল্লেখযোগ্যভাবে, PDPL এর বর্তমান সংস্করণটি সেলুলার পরিবেশের মধ্যে সীমাবদ্ধ কারণ এটির জন্য নীল আলোর আলো প্রয়োজন এবং গভীর টিস্যুতে প্রবেশ করতে পারে না।এই বৈশিষ্ট্যটি প্রাণীর মডেল অধ্যয়নে এর ব্যবহারকে বাদ দেয়।যাইহোক, PDPL এর সাথে অপটোজেনেটিক্সের সংমিশ্রণ প্রাণী গবেষণার জন্য একটি সুযোগ প্রদান করতে পারে, বিশেষ করে মস্তিষ্কে।এছাড়াও, অন্যান্য ইঞ্জিনিয়ারড ইনফ্রারেড ফটোসেন্সিটাইজারগুলিও এই সীমাবদ্ধতাটি সরিয়ে দেয়।বর্তমানে এই এলাকায় গবেষণা চলছে।
HEK293T সেল লাইনটি ATCC (CRL-3216) থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল।কোষের লাইনটি মাইকোপ্লাজমা সংক্রমণের জন্য নেতিবাচক পরীক্ষা করে এবং 10% ভ্রূণের বোভাইন সিরাম (FBS, Vistech, #SE100-B) এবং 1% পেনিসিলিন/স্ট্রেপ্টোমাইসিন (হাইক্লোন, #SV3) দিয়ে পরিপূরক DMEM (থার্মো, #C11995500BT) তে সংষ্কৃত করা হয়েছিল।বড় হয়েছে
3-অ্যামিনোফেনিলিন (নমুনা 3) এবং (4-ইথিনাইলফেনাইল) মিথানামাইন (নমুনা 4) বিডেফার্ম থেকে কেনা হয়েছিল।প্রোপিলামাইন (প্রোব 2) এনার্জি-কেমিক্যাল থেকে কেনা হয়েছিল।এন-(2-অ্যামিনোফেনাইল)পেন্ট-4-ইনামাইড (প্রোব 1) প্রকাশিত পদ্ধতি অনুসারে সংশ্লেষিত হয়েছিল।
পরিপূরক সারণী 1 এই গবেষণায় ব্যবহৃত জেনেটিক গঠন তালিকাভুক্ত করে।মিনিএসওজি এবং কিলার রেড সিকোয়েন্সগুলি পি. জোউ (পিকিং বিশ্ববিদ্যালয়) থেকে একটি উপহার প্লাজমিড থেকে ক্লোন করা হয়েছিল।মাইটোকন্ড্রিয়াল ম্যাট্রিক্স টার্গেটিং সিকোয়েন্সটি COX4 এর 23টি এন-টার্মিনাল অ্যামিনো অ্যাসিড থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল এবং একটি গিবসন সমাবেশ (বেয়োটাইম, #D7010S) ব্যবহার করে নির্দেশিত ভেক্টরগুলিতে ক্লোন করা হয়েছিল।এন্ডোপ্লাজমিক রেটিকুলামের ঝিল্লি এবং নিউক্লিয়াসকে লক্ষ্য করার জন্য, HEK293T কোষের একটি cDNA লাইব্রেরি থেকে PCR দ্বারা SEC61B হিউম্যান ডিএনএ (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) এবং H2B ডিএনএ (ডি. লিন, শেনজেন দ্বারা দান করা) এবং উপরে উল্লিখিত হিসাবে ক্লোন করা হয়েছে।অন্যথায় নির্দেশিত না হলে, স্থিতিশীল সেল লাইনের স্থানান্তর এবং নির্মাণের জন্য ব্যবহৃত অন্যান্য প্রোটিন জিনগুলি HEK293T সেল সিডিএনএ লাইব্রেরি থেকে পিসিআর প্রশস্ত করা হয়েছিল।G3S (GGGS) এবং G4S (GGGGS) টোপ প্রোটিন এবং মিনিএসওজি-এর মধ্যে সংযোগকারী হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।এই ফিউশন নির্মাণগুলিতে একটি V5 এপিটোপ ট্যাগ (GKPIPNPLLGLDST) যুক্ত করা হয়েছিল।স্তন্যপায়ী প্রাণীদের মধ্যে প্রকাশের জন্য এবং একটি স্থিতিশীল কোষ লাইন স্থাপনের জন্য, মিনিএসওজি ফিউশন কনস্ট্রাক্টটিকে pLX304 লেন্টিভাইরাল ভেক্টরে সাবক্লোন করা হয়েছিল।ব্যাকটেরিয়াল এক্সপ্রেশনের জন্য, miniSOG সি-টার্মিনাসে 6xHis লেবেলযুক্ত pET21a ভেক্টরে ক্লোন করা হয়েছিল।
HEK293T কোষগুলিকে ছয়-কূপ প্লেটে প্রতি কূপে 2.0 x 105 কোষে বীজ দেওয়া হয়েছিল এবং 24 ঘন্টা পরে রিকম্বিন্যান্ট লেন্টিভাইরাল প্লাজমিড (2.4 μg pLX304) এবং ভাইরাল প্যাকেজিং প্লাজমিড (1.5 μg psPAX2 এবং 1.2 μg psPAX2 এবং 1.2 LiBpog00 টাইম ব্যবহার করে) দিয়ে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল। , #C0533), প্রায় 80% ফিউশন।রাতারাতি স্থানান্তরের পরে, মাধ্যমটি পরিবর্তন করা হয়েছিল এবং আরও 24 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল।24, 48 এবং 72 ঘন্টা পরে ভাইরাস সংগ্রহ করা হয়েছিল।টার্গেট সেল লাইনের সংক্রমণের আগে, ভাইরাল মাধ্যমটি 0.8 μm ফিল্টার (Merck, #millex-GP) এর মাধ্যমে ফিল্টার করা হয়েছিল এবং পলিব্রেন (Solarbio, #H8761) 8 μg/ml এর ঘনত্বে যোগ করা হয়েছিল।24 ঘন্টা পরে, কোষগুলিকে মাধ্যম পরিবর্তন করে পুনরুদ্ধার করার অনুমতি দেওয়া হয়েছিল।নিম্ন কঠোর নির্বাচন হিসাবে প্রথম তিনটি প্যাসেজের জন্য 5 μg/ml ব্লাস্টিসিডিন (সোলারবিও, #3513-03-9) ব্যবহার করে কোষগুলি নির্বাচন করা হয়েছিল।তারপর পরবর্তী তিনটি প্যাসেজের জন্য আরও কঠোর নিয়ম হিসাবে 20 μg/ml ব্যবহার করা হয়।
কূপ প্রতি আনুমানিক 20,000 কোষের ঘনত্বে 12-কূপ চেম্বারে (Ibidi, #81201) কোষগুলি বীজ করা হয়েছিল।HEK293T কোষের আনুগত্য উন্নত করতে, ফসফেট বাফারযুক্ত স্যালাইনে (PBS, Sangon, #B640435) 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে মিশ্রিত 50 µg/ml ফাইব্রোনেক্টিন (কর্নিং, #356008) যোগ করুন।চেম্বারগুলি 1 ঘন্টার জন্য প্রিট্রিট করা হয়েছিল এবং তারপরে পিবিএস দিয়ে সরানো হয়েছিল।24 ঘন্টা পরে, কোষগুলি একবার পিবিএস দিয়ে ধুয়ে নেওয়া হয়, 1 মিমি প্রোব 3 দিয়ে তাজা হ্যাঙ্কসের সুষম লবণের দ্রবণে (HBSS, Gibco, #14025092) 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 1 ঘন্টার জন্য ধূসরিত হয় এবং তারপর একটি নীল এলইডি (460 এনএম) দিয়ে ইনকিউব করা হয়। )) ঘরের তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য বিকিরণ করা হয়েছিল।এর পরে, কোষগুলিকে দুবার পিবিএস দিয়ে ধুয়ে 4% ফর্মালডিহাইড দিয়ে পিবিএস (সানগন, #E672002) ঘরের তাপমাত্রায় 15 মিনিটের জন্য স্থির করা হয়েছিল।পিবিএস দিয়ে তিনবার ধুয়ে নির্দিষ্ট কোষ থেকে অতিরিক্ত ফর্মালডিহাইড সরানো হয়েছিল।কোষগুলিকে তখন পিবিএস-এ 0.5% ট্রাইটন এক্স-100 (সানগন, #A600198) দিয়ে প্রবেশ করানো হয়েছিল এবং পিবিএস দিয়ে 3 বার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল।তারপরে চেম্বারটি সরিয়ে ফেলুন এবং প্রতিটি নমুনায় যোগ করুন 25 μl ক্লিক প্রতিক্রিয়া মিশ্রণের মিশ্রণ যাতে 50 μM Cy3-azide (আলাদিন, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) রয়েছে। এবং 0.5 মিলিগ্রাম/মিলি সোডিয়াম অ্যাসকরবেট (আলাদিন, নং S105024) এবং ঘরের তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য ইনকিউব করা হয়।একটি স্ন্যাপ রিঅ্যাকশনের পর, 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) ধারণকারী PBS দিয়ে সেলগুলিকে ছয়বার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং তারপর 5% BSA (Abcone, #B24726) দিয়ে PBST-এ 30 মিনিটের জন্য রুমের তাপমাত্রায় ব্লক করা হয়েছিল।
কোলোকালাইজেশন ইমিউনোস্টেইনিংয়ের জন্য, কোষগুলিকে নির্দেশিত শর্ত অনুযায়ী প্রাথমিক অ্যান্টিবডি দিয়ে ইনকিউবেট করা হয়েছিল: মাউস অ্যান্টি-ভি5 ট্যাগ এমএবি (1:500, CST, #80076), খরগোশ অ্যান্টি-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), খরগোশের পলিক্লোনাল অ্যান্টি-ক্যালনেক্সিন অ্যান্টিবডি (1:500, Abcam, #ab22595) বা খরগোশ অ্যান্টি-ল্যামিন A/C মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি (1:500; CST, #2032) রাতারাতি 4 °C তাপমাত্রায়।পিবিএসটি দিয়ে 3 বার ধোয়ার পরে, কোষগুলিকে সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল: ছাগল-বিরোধী আলেক্সা ফ্লুর 488 (থার্মো, #A11034) 1:1000 মিশ্রিত, ছাগল-বিরোধী আলেক্সা ফ্লুর 594 (CST, #8889) 1:100 পাতলা।30 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় পাতলা করুন।তারপরে কোষগুলি পিবিএসটি দিয়ে 3 বার ধোয়া হয়েছিল এবং ঘরের তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য পিবিএস-এ DAPI (থার্মো, #D1306) দিয়ে পাল্টা স্টেইন করা হয়েছিল।পিবিএস দিয়ে 3টি ধোয়ার পরে, ইমেজিংয়ের জন্য পিবিএস-এ কোষগুলি 50% গ্লিসারল (সাঙ্গন, #A600232) এ সিল করা হয়েছিল।ইমিউনোফ্লুরোসেন্ট চিত্রগুলি একটি ZEISS LSM 900 Airyscan2 কনফোকাল মাইক্রোস্কোপ এবং ZNE 3.5 সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে প্রাপ্ত হয়েছিল।
একক অক্সিজেন ফ্লুরোসেন্ট ইমেজিংয়ের জন্য, হ্যাঙ্কস HEPES বাফারে (DOJINDO, #MT05) 100 nM Si-DMA যোগ করার আগে হ্যাঙ্কস HEPES বাফার দিয়ে কোষগুলি দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল।আলোর সংস্পর্শে আসার পরে, কোষগুলিকে 45 মিনিটের জন্য 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে একটি CO2 ইনকিউবেটরে ইনকিউবেট করা হয়েছিল।তারপরে কোষগুলিকে হ্যাঙ্কসের HEPES বাফার দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং 10 মিনিটের জন্য হ্যাঙ্কসের HEPES বাফারে Hoechst দিয়ে ঘরের তাপমাত্রায় কাউন্টারস্টেইন করা হয়েছিল এবং একটি ZEISS LSM 900 কনফোকাল মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে কল্পনা করা হয়েছিল।, #M36008) ক্যালসিয়াম এবং ম্যাগনেসিয়াম ধারণকারী HBSS বাফারে।আলো বা ডক্সোরুবিসিন (MCE, #HY-15142A) এর সংস্পর্শে আসার পরে, কোষগুলিকে একটি CO2 ইনকিউবেটরে 37 ° সে. তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল, HBSS বাফার দিয়ে দুবার ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল এবং ঘরের তাপমাত্রায় HBSS বাফারে Hoechst দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল।মিনিটডক্সোরুবিসিন একটি ইতিবাচক অনুসন্ধান নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল যেখানে কোষগুলিকে 20 μM ডক্সোরুবিসিন দিয়ে HBSS-এ 30 মিনিটের জন্য 1% BSA ধারণ করে চিকিত্সা করা হয়েছিল।ইমিউনোফ্লুরোসেন্ট চিত্রগুলি একটি Zeiss LSM 900 কনফোকাল মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে প্রাপ্ত হয়েছিল।
HEK293T কোষগুলি স্থিরভাবে মাইটো-মিনিএসওজি প্রকাশ করে 15 সেন্টিমিটার খাবারে প্রায় 30% ঘনত্বে বীজ করা হয়েছিল।48 ঘন্টা পরে, যখন ~80% সঙ্গমে পৌঁছেছিল, কোষগুলি একবার পিবিএস দিয়ে ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল, 1 মিমি প্রোব 3 দিয়ে তাজা এইচবিএসএস বাফারে 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 1 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল এবং তারপর ঘরে 10 মিনিটের জন্য একটি নীল এলইডি দিয়ে আলোকিত করা হয়েছিল। তাপমাত্রা.তারপরে, কোষগুলি পিবিএস দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল, স্ক্র্যাপ করা হয়েছিল এবং EDTA-মুক্ত প্রোটেজ ইনহিবিটরস (MCE, #HY-K0011) ধারণকারী বরফ-ঠান্ডা পিবিএস বাফারে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল।কোষ 1 মিনিটের জন্য টিপ sonicating দ্বারা lysed ছিল (35% প্রশস্ততা এ 1 সেকেন্ড চালু এবং 1 সেকেন্ড বন্ধ)।ফলস্বরূপ মিশ্রণটি ধ্বংসাবশেষ অপসারণের জন্য 4°C তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য 15,871 xg এ সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল, এবং একটি BCA প্রোটিন অ্যাস কিট (Beyotime, #P0009) ব্যবহার করে সুপারনাট্যান্ট ঘনত্ব 4 mg/mL এ সামঞ্জস্য করা হয়েছিল।উপরের 1 মিলি লাইসেটের সাথে 0.1 মিলিমিটার ফটোডিগ্রেডেবল বায়োটিন অ্যাজাইড (কনফ্লুর, #BBBD-14), 1 মিলিমিটার টিসিইপি (সাঙ্গন, #A600974), 0.1 মিলিমিটার টিবিটিএ লিগ্যান্ড (আলাদিন, #T162437) এবং নীচে 1 মিলিমিটার কিউবিএটারের সাথে একত্রিত করুন। ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য ঘূর্ণন।একটি স্ন্যাপ রিঅ্যাকশনের পর, 10 মিলিলিটার কাচের শিশিতে মিশ্রণটি পূর্ব-মিশ্রিত দ্রবণে (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) যোগ করুন।নমুনাগুলি মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং ঘরের তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য 4500 গ্রাম সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল।নীচের এবং উপরের দ্রবণগুলি বাতিল করা হয়েছিল, 1 মিলি মিথানল দিয়ে বর্ষণকে দুবার ধুয়ে 4 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 5 মিনিটের জন্য 15871×g সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল।1 মিলি 8 এম ইউরিয়া (আলাদিন, নং U111902) 25 মিলিমিটার অ্যামোনিয়াম বাইকার্বোনেট (ABC, আলাদিন, নং A110539) দ্রবীভূত করার জন্য যোগ করুন।নমুনাগুলিকে 10 মিমি ডিথিওথ্রিটল (সানগন, 25 মিমি এবিসিতে #A100281) 55 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 40 মিনিটের জন্য পুনর্গঠন করা হয়েছিল এবং তারপরে অন্ধকারে ঘরের তাপমাত্রায় 15 মিমি তাজা আয়োডোসেটামাইড (সানগন, #A600539) যোগ করা হয়েছিল।30 মিনিটের মধ্যে অ্যালকিলেশন।.প্রতিক্রিয়া বন্ধ করতে একটি অতিরিক্ত 5 মিমি ডিথিওথ্রিটল যোগ করা হয়েছিল।1 মিলি পিবিএস দিয়ে 3 বার ধুয়ে প্রতিটি নমুনার জন্য প্রায় 100 μl নিউট্রাভিডিন অ্যাগারোজ পুঁতি (থার্মো, #29202) প্রস্তুত করুন।উপরের প্রোটিওম দ্রবণটি 5 মিলি পিবিএস দিয়ে মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং ঘরের তাপমাত্রায় 4 ঘন্টার জন্য প্রাক-ধোয়া নিউট্রাভিডিন অ্যাগারোজ পুঁতি দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল।তারপর পুঁতিগুলি 0.2% SDS (Sangon, #A600485) সহ 5 মিলি পিবিএস দিয়ে 3 বার, 1M ইউরিয়াযুক্ত 5 মিলি পিবিএস দিয়ে 3 বার এবং 5 মিলি ডিডিএইচ2O দিয়ে 3 বার ধোয়া হয়েছিল।তারপর পুঁতিগুলিকে সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে সংগ্রহ করা হয় এবং 200 μl 25 mM ABC-তে পুনরায় স্থগিত করা হয় যাতে 1 M ইউরিয়া, 1 mM CaCl 2 (ম্যাকলিন, #C805228) এবং 20 ng/μl ট্রিপসিন (প্রোমেগা, #V5280) রয়েছে।ঘূর্ণন সহ 37°C এ রাতারাতি ট্রাইপসিনাইজ করুন।pH 2-3 না হওয়া পর্যন্ত ফর্মিক অ্যাসিড (থার্মো, # A117-50) যোগ করে প্রতিক্রিয়া বন্ধ করা হয়েছিল।পুঁতিগুলি 0.2% এসডিএসযুক্ত 1 মিলি পিবিএস দিয়ে 3 বার, 1 এম ইউরিয়াযুক্ত 1 মিলি পিবিএস দিয়ে 3 বার এবং তারপর 1 মিলি পাতিত জল দিয়ে 3 বার ধোয়া হয়েছিল৷পরিবর্তিত পেপটাইডগুলি 70% MeOH এর 200 μl ব্যবহার করে 90 মিনিটের জন্য হালকা লাইসিস (365 এনএম) দ্বারা প্রকাশ করা হয়েছিল।সেন্ট্রিফিউগেশনের পরে, সুপারনাট্যান্ট সংগ্রহ করা হয়েছিল।পুঁতিগুলিকে 70% MeOH এর 100 μl দিয়ে একবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং সুপারনাট্যান্টগুলি পুল করা হয়েছিল।নমুনাগুলি একটি স্পিডভ্যাক ভ্যাকুয়াম কনসেনট্রেটরে শুকানো হয়েছিল এবং বিশ্লেষণ না হওয়া পর্যন্ত -20 ডিগ্রি সেলসিয়াসে সংরক্ষণ করা হয়েছিল।
একক অক্সিজেন পরিবর্তিত পেপটাইড সনাক্ত করতে এবং পরিমাপ করার জন্য, নমুনাগুলিকে 0.1% ফর্মিক অ্যাসিডে পুনরায় দ্রবীভূত করা হয়েছিল এবং 1 μg পেপটাইডগুলি বিক্রেতা সফ্টওয়্যার 43 থেকে Tune এবং Xcalibur থেকে একটি ন্যানো ESI উত্স দিয়ে সজ্জিত একটি অরবিট্র্যাপ ফিউশন লুমোস ট্রিব্রিড ভর স্পেকট্রোমিটার ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল৷নমুনাগুলি একটি 75 µm × 15 সেমি অভ্যন্তরীণভাবে প্যাক করা কৈশিক কলামে 3 µm C18 উপাদান (ReproSil-pur, #r13.b9.) দিয়ে আলাদা করা হয়েছিল এবং একটি EASY-nLC 1200 UHPLC সিস্টেম (থার্মো) এর সাথে সংযুক্ত ছিল।পেপটাইডগুলি রৈখিক 95 মিনিটের গ্রেডিয়েন্ট ক্রোমাটোগ্রাফি দ্বারা 8% দ্রাবক B থেকে 50% দ্রাবক B (জলে A = 0.1% ফরমিক অ্যাসিড, 80% অ্যাসিটোনিট্রিলে B = 0.1% ফর্মিক অ্যাসিড) দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল, তারপর রৈখিকভাবে 98% B মিনিটে বৃদ্ধি করা হয়েছিল। 300 nl/মিনিট প্রবাহ হারে 6 মিনিটের মধ্যে।অরবিট্র্যাপ ফিউশন লুমোস ডেটার উপর নির্ভর করে সম্পূর্ণ MS স্ক্যান এবং MS2 স্ক্যানের মধ্যে পর্যায়ক্রমে ডেটা সংগ্রহ করে।স্পুটারিং ভোল্টেজ 2.1 কেভিতে সেট করা হয়েছিল এবং আয়ন পরিবহন কৈশিকের তাপমাত্রা ছিল 320 ডিগ্রি সেলসিয়াস।MS স্পেকট্রা (350-2000 m/z) 120,000 এর রেজোলিউশন, AGC 4 × 105, এবং সর্বোচ্চ 150 ms ইনপুট সময় সহ সংগ্রহ করা হয়েছিল।প্রতিটি পূর্ণ স্ক্যানে 10টি সর্বাধিক সাধারণ মাল্টিপ্লাই চার্জযুক্ত অগ্রদূতকে 30% এর স্বাভাবিক সংঘর্ষের শক্তি, 1.6 m/z এর একটি চতুর্ভুজ বিচ্ছিন্নতা উইন্ডো এবং 30,000 এর রেজোলিউশন সেটিং সহ HCD ব্যবহার করে খণ্ডিত করা হয়েছিল।5x104 এবং সর্বোচ্চ ইনপুট সময় 150 ms ব্যবহার করে ট্যান্ডেম ভর স্পেকট্রোমেট্রির জন্য একটি AGC লক্ষ্য।গতিশীল ব্যতিক্রম 30 সেকেন্ডে সেট করা হয়েছে। আনঅ্যাসাইন করা আয়ন বা যাদের চার্জ 1+ এবং >7+ MS/MS-এর জন্য প্রত্যাখ্যান করা হয়েছিল। আনঅ্যাসাইন করা আয়ন বা যাদের চার্জ 1+ এবং >7+ MS/MS-এর জন্য প্রত্যাখ্যান করা হয়েছিল। Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ এবং >7+ были отклонены для МС/МС. 1+ এবং >7+ চার্জ সহ আনঅ্যাসাইন করা আয়ন বা আয়ন MS/MS-এর জন্য প্রত্যাখ্যান করা হয়েছিল।未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ এবং >7+ были отклонены для МС/МС. 1+ এবং >7+ চার্জ সহ অনির্দিষ্ট আয়ন বা আয়নগুলি MS/MS-এর জন্য প্রত্যাখ্যান করা হয়েছিল।
MSFragger ভিত্তিক FragPipe কম্পিউটিং প্ল্যাটফর্ম ব্যবহার করে কাঁচা ডেটা প্রক্রিয়া করা হয়।ভর পক্ষপাত এবং সংশ্লিষ্ট অ্যামিনো অ্যাসিডগুলি -150 থেকে 500 Da এর পূর্ববর্তী ভর সহনশীলতার সাথে একটি খোলা অনুসন্ধান অ্যালগরিদম ব্যবহার করে নির্ধারণ করা হয়েছিল।সংশোধিত পেপটাইডগুলি পিডিতে +229.0964 এবং +247.1069 Da (প্রোটিওম ডিসকভারার 2.5, থার্মো) এর ভর বৃদ্ধির সাথে হিস্টিডিন পরিবর্তন ব্যবহার করে চিহ্নিত করা হয়েছিল।
ফিউজড মিনিএসওজি জিনকে স্থিরভাবে প্রকাশকারী কোষগুলিকে 6 সেন্টিমিটার থালায় প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল।~80% সঙ্গমে পৌঁছানোর পরে, কোষগুলি একবার HBSS (Gibco, #14025092) দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়, তারপর 37°C তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য HBSS-এ রাসায়নিক প্রোব দিয়ে ধূনো হয় এবং নীল আলোতে আলোকিত হয়।ঘরের তাপমাত্রায় 20 মিনিটের জন্য 10W LED।PDPL-এ কোন ধরনের প্রতিক্রিয়াশীল অক্সিজেন প্রজাতি জড়িত তা নির্ধারণ করতে, 0.5 mM ভিটামিন C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (সিগমা, #7789-20-0) , 100 মিমি ম্যানিটল (এনার্জি কেমিক্যাল, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 পরিপূরক হিসাবে কোষে যোগ করা হয়েছিল।ঠান্ডা পিবিএস দিয়ে ধোয়ার পরে, কোষগুলিকে স্ক্র্যাপ করা হয়েছিল, 1.5 মিলি সেন্ট্রিফিউজ টিউবগুলিতে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং EDTA ছাড়াই 1x প্রোটিজ ইনহিবিটর সহ PBS এর 200 μl এ 1 মিনিটের জন্য একটি টিপ দিয়ে সোনিক করা হয়েছিল (1 s এবং 1 s ছাড়া, প্রশস্ততা 35%)।ফলস্বরূপ মিশ্রণটি 4 °C তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য 15,871 × g এ সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং একটি বিসিএ প্রোটিন অ্যাস কিট ব্যবহার করে সুপারনাট্যান্ট ঘনত্ব 1 মিলিগ্রাম / এমএল এ সামঞ্জস্য করা হয়েছিল।উপরোক্ত লাইসেটের প্রায় 50 μl 0.1 মিমি রোডামাইন অ্যাজিড (আলাদিন, নং T131368), 1 মিমি টিসিইপি, 0.1 মিমি টিবিটিএ লিগ্যান্ড এবং 1 মিমি কিউএসও 4 দিয়ে 1 ঘন্টার জন্য ঘরের তাপমাত্রায় নীচে থেকে উপরে ঘূর্ণন সহ ইনকিউবেট করা হয়েছিল।ক্লিক প্রতিক্রিয়ার পরে, নমুনাগুলিতে 250 μl প্রি-চিল্ড অ্যাসিটোন যোগ করে, 20 মিনিটের জন্য -20 ডিগ্রি সেলসিয়াসে ইনকিউব করে এবং 4 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 10 মিনিটের জন্য 6010×g সেন্ট্রিফিউজিং করে অ্যাসিটোনের সাথে বৃষ্টিপাত করা হয়েছিল।পেলেটটি সংগ্রহ করুন এবং 1x লায়েম্মলির বাফারের 50 μl এ 95 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 10 মিনিটের জন্য সিদ্ধ করুন।তারপরে SDS-PAGE দীর্ঘ জেলগুলিতে নমুনাগুলি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং ইমেজ ল্যাব টাচ সফ্টওয়্যার সহ বায়ো-রেড কেমিডক এমপি টাচ ইমেজিং সিস্টেম ব্যবহার করে কল্পনা করা হয়েছিল।
রিকম্বিন্যান্ট miniSOG-6xHis প্রোটিনের অভিব্যক্তি এবং পরিশোধন পূর্বে বর্ণিত হিসাবে সম্পাদিত হয়েছিল।সংক্ষেপে, E. coli BL21(DE3) কোষগুলি (TransGen, #CD701-02) pET21a-miniSOG-6xHis দিয়ে রূপান্তরিত হয়েছিল এবং প্রোটিন এক্সপ্রেশন 0.5 মিমি আইপিটিজি (সানগন, #A600168) দিয়ে প্ররোচিত হয়েছিল।সেল লাইসিসের পরে, প্রোটিনগুলিকে Ni-NTA অ্যাগারোজ পুঁতি (MCE, নং 70666) ব্যবহার করে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল, PBS এর বিরুদ্ধে ডায়ালাইজ করা হয়েছিল এবং -80°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল।
অ্যান্টিবডি-ভিত্তিক ইন ভিট্রো লেবেল প্রক্সিমিটি অ্যাস-এর জন্য, PBS-এ 100 μM পিউরিফাইড মিনিএসওজি, 1 মিমি প্রোব 3, এবং 1 μg অ্যান্টি-লেবেল মাউস মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি (ট্রান্সজেন, #HT501-01) মিশ্রিত করুন মোট প্রতিক্রিয়ার পরিমাণ 50 μl।.প্রতিক্রিয়া মিশ্রণটি ঘরের তাপমাত্রায় 0, 2, 5, 10 এবং 20 মিনিটের জন্য নীল এলইডি আলো দিয়ে বিকিরণ করা হয়েছিল।মিশ্রণটি 0.1 মিমি বায়োটিন-পিইজি৩-অ্যাজাইড (আলাদিন, #B122225), 1 মিমি টিসিইপি, 0.1 মিমি টিবিটিএ লিগ্যান্ড, এবং 1 মিমি কিউএসও 4 দিয়ে 1 ঘন্টার জন্য একটি ঊর্ধ্বগামী মোশন শেকারে ঘরের তাপমাত্রায় ইনকিউব করা হয়েছিল।একটি স্ন্যাপ রিঅ্যাকশনের পর, মিশ্রণে সরাসরি 4x লেইম্মলির বাফার যোগ করুন এবং 95°C তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য ফুটান।SDS-PAGE জেলগুলিতে নমুনাগুলি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং স্ট্রেপ্টাভিডিন-এইচআরপি (1:1000, সোলারবিও, #SE068) দিয়ে ওয়েস্টার্ন ব্লটিং দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
সি-টার্মিনাল অ্যামিডেশন (LHDALDAK-CONH2) সহ একটি হিস্টিডিনযুক্ত সিন্থেটিক পেপটাইড কাছাকাছি পেপটাইড-ভিত্তিক ইন ভিট্রো লেবেলিং বিশ্লেষণ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।এই পরীক্ষায়, 100 μM বিশুদ্ধ মিনিএসওজি, 10 মিমি প্রোব 3 এবং 2 μg/ml সিন্থেটিক পেপটাইড 50 μl এর মোট প্রতিক্রিয়া ভলিউমে পিবিএস-এ মিশ্রিত হয়েছিল।প্রতিক্রিয়া মিশ্রণটি ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য নীল এলইডি আলো দিয়ে বিকিরণ করা হয়েছিল।নমুনার এক মাইক্রোলিটার একটি LC-MS সিস্টেম ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight MassLynx স্পেকট্রাম বিশ্লেষণ সফ্টওয়্যার সহ স্পেকট্রোমিটার)।
মিনিএসওজি ফিউশন জিনকে স্থিরভাবে প্রকাশকারী HEK293T কোষগুলিকে বিভিন্ন অর্গানেল স্থানীয়করণ (মিটো, ইআর, নিউক্লিয়াস) এবং পার্কিন-মিনিএসওজি এবং বিআরডি4-মিনিএসওজি লাইনের জন্য 15 সেমি খাবারের জন্য 10 সেমি ডিশে বীজ দেওয়া হয়েছিল।~90% সঙ্গমে পৌঁছানোর পর, কোষগুলি একবার এইচবিএসএস দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়, তারপর 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 1 ঘন্টার জন্য এইচবিএসএস-এ প্রোব 3 দিয়ে ইনকিউব করা হয় এবং ঘরের তাপমাত্রায় 10 ওয়াট নীল এলইডি দিয়ে আলোকিত করা হয়।পারকিনের নন-কন্টাক্ট লেবেলিংয়ের জন্য, HBSS-এ প্রোব 3 সহ 10 µM প্রোটন কার্বনাইল সায়ানাইড ক্যারিয়ার m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) 37°C তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য যোগ করা হয়েছিল।সেল লাইসিস, ক্লিক কেমিস্ট্রি, রিডাকশন এবং অ্যালকিলেশন ধাপগুলি উপরে বর্ণিত হিসাবে একই ছিল, 2 মিলিগ্রাম লাইসেট যোগ করা হয়েছিল এবং ফটোডিগ্রেডেবল বায়োটিন অ্যাজাইডের পরিবর্তে ক্লিক প্রতিক্রিয়ায় বায়োটিন PEG3 আজাইড ব্যবহার করা হয়েছিল।সমৃদ্ধকরণের পরে, পুঁতিগুলি 0.2% এসডিএসযুক্ত 5 মিলি পিবিএস দিয়ে 3 বার, 1 এম ইউরিয়াযুক্ত 5 মিলি পিবিএস দিয়ে 3 বার এবং 5 মিলি পিবিএস দিয়ে 3 বার ধোয়া হয়েছিল।তারপরে, 37°C তাপমাত্রায় রাতারাতি প্রোটিন ক্লিভ করার জন্য 300 μl 25 mM ABC-তে 2 µg ট্রিপসিন যোগ করা হয়েছিল যাতে 1 M ইউরিয়া থাকে।2-3 এর pH না হওয়া পর্যন্ত ফর্মিক অ্যাসিড যোগ করে প্রতিক্রিয়া বন্ধ করা হয়েছিল।পুঁতির উপর ট্রাইপসিনাইজেশন করার পর, পেপটাইড দ্রবণটি একটি SOLAµ HRP কলাম (থার্মো, #60209-001) ব্যবহার করে ডিসল্ট করা হয় এবং একটি স্পিডভ্যাক ভ্যাকুয়াম কনসেনট্রেটারে শুকানো হয়।পেপটাইডগুলিকে 0.1% ফর্মিক অ্যাসিডে পুনরায় দ্রবীভূত করা হয়েছিল এবং উপরে বর্ণিত ন্যানো-ইএসআই উত্স দিয়ে সজ্জিত একটি অরবিট্র্যাপ ফিউশন লুমোস ট্রিব্রিড ভর স্পেকট্রোমিটার ব্যবহার করে 500 এনজি পেপটাইড বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।পেপটাইডগুলি বাণিজ্যিক RP-HPLC প্রিকলাম (75 μm x 2 সেমি) (থার্মো, নং 164946) এবং বিশ্লেষণাত্মক RP-HPLC কলাম (75 μm x 25 সেমি) (থার্মো, নং 164941) এ পৃথক করা হয়েছিল, উভয়ই 2 μm দিয়ে পূর্ণ।60 মিনিটের মধ্যে 8% থেকে 35% ACN পর্যন্ত গ্রেডিয়েন্ট, তারপর 300 Nl/মিনিটের প্রবাহ হারে 6 মিনিটের মধ্যে রৈখিকভাবে 98% B পর্যন্ত বৃদ্ধি পায়।MS স্পেকট্রা (350-1500 m/z) 60,000 এর রেজোলিউশন, AGC 4 × 105, এবং সর্বাধিক 50 ms ইনপুট সময় সহ সংগ্রহ করা হয়েছিল।নির্বাচিত আয়নগুলিকে 3 s চক্রে HCD দ্বারা ক্রমিকভাবে খণ্ডিত করা হয়েছিল 30% এর স্বাভাবিক সংঘর্ষ শক্তি, 1.6 m/z এর একটি চতুর্ভুজ বিচ্ছিন্নতা উইন্ডো এবং 15000 এর রেজোলিউশন। একটি 5 × 104 টেন্ডেম ভর স্পেকট্রোমিটার AGC লক্ষ্য এবং সর্বোচ্চ ইনজেকশন সময় 22 ms ব্যবহার করা হয়েছিল।গতিশীল বর্জন 45 সেকেন্ডে সেট করা হয়েছে। আনঅ্যাসাইন করা আয়ন বা যাদের চার্জ 1+ এবং >7+ MS/MS-এর জন্য প্রত্যাখ্যান করা হয়েছিল। আনঅ্যাসাইন করা আয়ন বা যাদের চার্জ 1+ এবং >7+ MS/MS-এর জন্য প্রত্যাখ্যান করা হয়েছিল। Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ এবং >7+ были отклонены для МС/МС. 1+ এবং >7+ চার্জ সহ আনঅ্যাসাইন করা আয়ন বা আয়ন MS/MS-এর জন্য প্রত্যাখ্যান করা হয়েছিল।未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ এবং >7+ были отклонены для МС/МС. 1+ এবং >7+ চার্জ সহ অনির্দিষ্ট আয়ন বা আয়নগুলি MS/MS-এর জন্য প্রত্যাখ্যান করা হয়েছিল।
নিউট্রাভিডিন পুঁতির সমৃদ্ধকরণ পর্যন্ত নমুনা প্রস্তুতির ধাপগুলি উপরে বর্ণিত এলসি-এমএস/এমএস বিশ্লেষণের মতোই ছিল।আনুমানিক 50 μg লাইসেট লোডিং নিয়ন্ত্রণের জন্য ইনপুট হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল এবং 2 মিলিগ্রাম লাইসেট ক্লিক প্রতিক্রিয়াগুলির জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল।নিউট্রাভিডিন দিয়ে সমৃদ্ধকরণ এবং ধোয়ার পর, আবদ্ধ প্রোটিনগুলিকে অ্যাগারোজ রজন পুঁতিতে 50 μl লেইম্মলির বাফার যোগ করে এবং 95 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 5 মিনিটের জন্য ফুটিয়ে তোলা হয়।কন্ট্রোল লোড ইনপুট এবং পুঁতি সমৃদ্ধ নমুনাগুলি SDS-PAGE দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং স্ট্যান্ডার্ড ওয়েস্টার্ন ব্লট পদ্ধতি দ্বারা PVDF মেমব্রেনে (মিলিপুর, #ISEQ00010) স্থানান্তরিত হয়েছিল।ঝিল্লিগুলি টিবিএস-এ 5% স্কিম মিল্ক (Sangon, #A600669) দিয়ে ব্লক করা হয়েছিল যাতে 0.1% tween-20 (TBST) থাকে এবং প্রাথমিক এবং সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিগুলির সাথে ক্রমানুসারে ইনকিউব করা হয়।প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলি টিবিএসটি-তে 5% স্কিম মিল্কে 1:1000 মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং 4 ডিগ্রি সেলসিয়াস তাপমাত্রায় রাতারাতি ইনকিউব করা হয়েছিল।সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিগুলি 1:5000 অনুপাতে ব্যবহার করা হয়েছিল এবং ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল।কেমিডক এমপি ইমেজিং সিস্টেম ব্যবহার করে ঝিল্লিগুলি কেমিলুমিনেসেন্স দ্বারা কল্পনা করা হয়েছিল।চিত্রে ব্লট এবং জেলের সমস্ত আনকাট স্ক্যানগুলি কাঁচা ডেটা হিসাবে উপস্থাপন করা হয়েছে।
এই গবেষণায় ব্যবহৃত প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলির মধ্যে খরগোশের অ্যান্টি-এসএফপিকিউ মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি (CST, নং 71992), খরগোশ অ্যান্টি-FUS মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি (CST, নং 67840), খরগোশ অ্যান্টি-NSUN2 পলিক্লোনাল অ্যান্টিবডি (প্রোটিনটেক, নং 20854-1-) অন্তর্ভুক্ত ছিল। AP), খরগোশ অ্যান্টি-mSin3A পলিক্লোনাল অ্যান্টিবডি (Abcam, #ab3479), মাউস অ্যান্টি-ট্যাগ মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি (TransGen, #HT201-02), মাউস অ্যান্টি-β-অ্যাক্টিন মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি (TransGen, #HC201-01), খরগোশ অ্যান্টিবডি -CDK2 মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি (ABclonal, #A0094), খরগোশের মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি থেকে CTBP1 (ABclonal, #A11600), খরগোশের পলিক্লোনাল অ্যান্টিবডি থেকে DUT (ABclonal, #A2901), খরগোশের পলিক্লোনাল অ্যান্টিবডি থেকে PSMC4 (ABclonal, #A2505), খরগোশের পলিক্লোনাল অ্যান্টিবডি। DNAJB1 পলিক্লোনাল অ্যান্টিবডি (ABclonal, # A5504)।এই অ্যান্টিবডিগুলি টিবিএসটি-তে 5% স্কিম মিল্কে 1:1000 পাতলা করে ব্যবহার করা হয়েছিল।এই গবেষণায় ব্যবহৃত সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিগুলির মধ্যে রয়েছে অ্যান্টি-র্যাবিট IgG (TransGen, #HS101-01), অ্যান্টি-মাউস IgG (TransGen, #HS201-01) 1:5000 ডিলিউশনে।
BRD4 SFPQ এর সাথে ইন্টারঅ্যাক্ট করে কিনা তা আরও তদন্ত করতে, স্থিতিশীল HEK293T এবং BRD4-miniSOG কোষগুলি HEK293T ওভার এক্সপ্রেস করে 10 সেন্টিমিটার ডিশে প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল।কোষগুলি ঠান্ডা পিবিএস দিয়ে ধুয়ে 1 মিলি পিয়ার্স আইপি লাইসিস বাফারে (থার্মো ফিশার, #87787) 4 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 30 মিনিটের জন্য ইডিটিএ-মুক্ত প্রোটেজ ইনহিবিটর দিয়ে লাইজ করা হয়েছিল।এর পরে, লাইসেটগুলি 1.5 মিলি সেন্ট্রিফিউজ টিউবে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং 10 মিনিটের জন্য 4 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 15,871 xg সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল।4°C তাপমাত্রায় রাতারাতি 5 µg অ্যান্টি-V5 লেবেলযুক্ত মাউস মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি (CST, #80076) দিয়ে সুপারনাট্যান্ট সংগ্রহ করা হয়েছিল।আনুমানিক 50 μl প্রোটিন A/G চৌম্বক পুঁতি (MCE, #HY-K0202) 0.5% Tween-20 ধারণকারী PBS দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলুন।তারপর সেল লাইসেটগুলিকে চৌম্বক পুঁতির সাহায্যে 4 ঘন্টার জন্য 4°C তাপমাত্রায় নিচ থেকে উপরে ঘূর্ণন করা হয়।তারপর পুঁতিগুলিকে 1 মিলি পিবিএসটি বাফার দিয়ে চারবার ধুয়ে 95 ডিগ্রি সেন্টিগ্রেডে 5 মিনিটের জন্য সিদ্ধ করা হয়েছিল।নমুনাগুলি এসডিএস-পেজ জেলগুলিতে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং স্ট্যান্ডার্ড ওয়েস্টার্ন ব্লট পদ্ধতি ব্যবহার করে পিভিডিএফ ঝিল্লিতে স্থানান্তরিত হয়েছিল।ঝিল্লিগুলি টিবিএসটি-তে 5% স্কিম মিল্কে ব্লক করা হয়েছিল এবং প্রাথমিক এবং মাধ্যমিক অ্যান্টিবডিগুলির সাথে ক্রমানুসারে ইনকিউবেট করা হয়েছিল।প্রাথমিক অ্যান্টিবডি র্যাবিট অ্যান্টি-এসএফপিকিউ মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি (সিএসটি, #71992) টিবিএসটি-তে 5% স্কিম মিল্কের মধ্যে 1:1000 অনুপাতে ব্যবহার করা হয়েছিল এবং 4 ডিগ্রি সেলসিয়াসে রাতারাতি ইনকিউব করা হয়েছিল।অ্যান্টি-র্যাবিট আইজিজি 1:5000 অনুপাতে ব্যবহার করা হয়েছিল এবং ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল।কেমিডক এমপি ইমেজিং সিস্টেম ব্যবহার করে ঝিল্লিগুলি কেমিলুমিনেসেন্স দ্বারা কল্পনা করা হয়েছিল।
সলভেন্ট অ্যাক্সেসিবল সারফেস এরিয়া (SASA) বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহৃত সমস্ত কাঠামো প্রোটিন ডেটা ব্যাংক (PDB)52 বা আলফাফোল্ড প্রোটিন স্ট্রাকচার ডেটাবেস53 থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল।FreeSASA প্রোগ্রাম ব্যবহার করে প্রতিটি অবশিষ্টাংশের জন্য পরম SASA গণনা করা হয়েছিল।লেবেলযুক্ত হিস্টিডিন এবং এর প্রতিবেশীদের জন্য শুধুমাত্র সম্পূর্ণ এবং দ্ব্যর্থহীন SASA ডেটা প্রতিটি কাঠামোর জন্য গড় SASA পেতে ব্যবহৃত হয়েছিল।প্রতিটি হিস্টিডিনের আপেক্ষিক দ্রাবক অ্যাক্সেসিবিলিটি (RSA) দ্রাবকের কাছে উপলব্ধ অভিজ্ঞতামূলক সর্বাধিক সম্ভাব্য অবশিষ্টাংশ পৃষ্ঠের ক্ষেত্র দ্বারা পরম SASA মানকে ভাগ করে গণনা করা হয়েছিল।সমস্ত হিস্টিডাইনগুলি তখন লুকানো হিসাবে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল যদি গড় RSA 20% এর নীচে হয়, অন্যথায় প্রকাশিত হয়56।
ডিডিএ মোডে প্রাপ্ত কাঁচা ফাইলগুলি প্রোটিওম ডিসকভারার (v2.5) বা MSfragger (Fragpipe v15.0) ব্যবহার করে উপযুক্ত সুইসপ্রট যাচাইকৃত প্রোটিন ডাটাবেসে সাধারণ দূষকগুলি সহ অনুসন্ধান করা হয়েছিল।পেপটাইডগুলির জন্য দুটি অনুপস্থিত ক্লিভেজ সাইট সহ সম্পূর্ণ ট্রিপসিনের প্রয়োজন ছিল, একটি নির্দিষ্ট পরিবর্তন হিসাবে কার্বামাইল মিথিলেশন এবং গতিশীল পরিবর্তন হিসাবে মেথিওনিন অক্সিডেশন।পূর্ববর্তী এবং খণ্ড ওজন সহনশীলতা যথাক্রমে 10 পিপিএম এবং 0.02 ডা (MS2 অরবিট্র্যাপ) এ সেট করা হয়েছিল। দূষিত হিটগুলি সরানো হয়েছিল, এবং <1% মিথ্যা আবিষ্কারের হার পেতে প্রোটিনগুলি ফিল্টার করা হয়েছিল। দূষিত হিটগুলি সরানো হয়েছিল, এবং <1% মিথ্যা আবিষ্কারের হার পেতে প্রোটিনগুলি ফিল্টার করা হয়েছিল। Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэфициент ложного %. দূষিত হিটগুলি সরানো হয়েছিল এবং প্রোটিনগুলিকে <1% এর মিথ্যা সনাক্তকরণ হার দিতে ফিল্টার করা হয়েছিল।去除污染物命中,过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率. <1% 的错误发现率. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаружени %.1 দূষিত হিটগুলি সরানো হয়েছিল এবং <1% এর মিথ্যা ইতিবাচক হার অর্জনের জন্য প্রোটিনগুলি ফিল্টার করা হয়েছিল।লেবেল ব্যবহার না করে পরিমাণগত বিশ্লেষণের জন্য, তিনটি জৈবিক পুনরাবৃত্তি থেকে স্বাভাবিক প্রোটিন সামগ্রী ব্যবহার করা হয়েছিল।প্রোটিন সাবসেলুলার স্থানীয়করণ বিশ্লেষণ DAVID বায়োইনফরমেটিক্স রিসোর্সেস, MitoCarta 3.0 এবং অ্যালিস টিং গ্রুপ দ্বারা সংকলিত এবং প্রকাশিত ডেটাবেস থেকে জিন অন্টোলজি (GO) বিশ্লেষণ ব্যবহার করে সম্পাদিত হয়েছিল।আগ্নেয়গিরির মানচিত্রটি পার্সিয়াস (v1.6.15.0) থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল। প্রোটিনের প্রাচুর্যের ভাঁজ পরিবর্তনগুলি পরিসংখ্যানগত তাত্পর্যের জন্য একটি দ্বি-পার্শ্বযুক্ত টি-পরীক্ষা ব্যবহার করে পরীক্ষা করা হয়েছিল, এবং প্রোটিন হিটগুলি প্রাচুর্য পরিবর্তন > 2 (অন্যথায় বলা না থাকলে) এবং p মান <0.05 দিয়ে চিহ্নিত করা হয়েছিল। প্রোটিনের প্রাচুর্যের ভাঁজ পরিবর্তনগুলি পরিসংখ্যানগত তাত্পর্যের জন্য একটি দ্বি-পার্শ্বযুক্ত টি-পরীক্ষা ব্যবহার করে পরীক্ষা করা হয়েছিল, এবং প্রোটিন হিটগুলি প্রাচুর্য পরিবর্তন > 2 (অন্যথায় বলা না থাকলে) এবং p মান <0.05 দিয়ে চিহ্নিত করা হয়েছিল। Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. প্রোটিন সামগ্রীর ভাঁজ পরিবর্তনগুলি পরিসংখ্যানগত তাত্পর্যের জন্য একটি দ্বি-টেইলড টি-টেস্ট ব্যবহার করে পরীক্ষা করা হয়েছিল এবং প্রোটিন মিলগুলি বিষয়বস্তু পরিবর্তন >2 (অন্যথায় উল্লেখ না থাকলে) এবং ap মান <0.05 দিয়ে চিহ্নিত করা হয়েছিল।双边 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 倍数 变化 的 统计 显着性 ， 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （除非 另 另 有 说明） 和 পি 值 <0.05。。。双边 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 蛋白质 中 的 丰度 变化> 2 （另 有 说明） 和 পি 值 <0.05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. প্রোটিন সামগ্রীতে ভাঁজ পরিবর্তনের পরিসংখ্যানগত তাত্পর্য একটি দ্বি-টেইলড টি-টেস্ট ব্যবহার করে পরীক্ষা করা হয়েছিল, এবং প্রোটিন মিলগুলি বিষয়বস্তু পরিবর্তনের জন্য নির্ধারিত হয়েছিল >2 (অন্যথায় নির্দেশিত না হলে) এবং p-মান <0.05।স্ট্রিং ডাটাবেসের সাথে জিও বিশ্লেষণ ব্যবহার করে প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
অনুরূপ ফলাফল সহ তিনটি জৈবিক প্রতিলিপি করা হয়েছিল।গ্রাফপ্যাড প্রিজম (গ্রাফপ্যাড সফ্টওয়্যার) দিয়ে পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং পার্সিয়াস (v1.6.15.0) দিয়ে আগ্নেয়গিরির প্লট তৈরি করা হয়েছিল।দুটি গোষ্ঠীর তুলনা করার জন্য, পি-মানগুলি একটি টু-টেইল্ড স্টুডেন্টস টি-টেস্ট ব্যবহার করে নির্ধারণ করা হয়েছিল।পরীক্ষামূলক গোষ্ঠীতে অন্তত দুবার চিহ্নিত শুধুমাত্র সিঙ্গেলটন প্রোটিনগুলিকে আগ্নেয়গিরির প্লটগুলিতে অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল এবং নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর অনুপস্থিত মানগুলিকে একটি সাধারণ বিতরণ থেকে পার্সিয়াসের সাথে প্রতিস্থাপিত করা হয়েছিল যাতে পি-মান গণনা করা যায়।ত্রুটি বারগুলি গড় ± আদর্শ বিচ্যুতিকে উপস্থাপন করে।পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণের জন্য প্রোটিওমিক বিশ্লেষণে, প্রোটিনের প্রাচুর্য যা কমপক্ষে দুটি জৈবিক প্রতিলিপিতে উপস্থিত হয়েছিল তা ধরে রাখা হয়েছিল।নমুনার আকার পূর্ব-নির্ধারণ করতে পরিসংখ্যানগত পদ্ধতি ব্যবহার করা হয়নি।পরীক্ষাগুলো এলোমেলো নয়।গবেষকরা ফলাফলের পরীক্ষা এবং মূল্যায়নের সময় কাজের প্রতি অন্ধ ছিলেন না।
অধ্যয়নের নকশা সম্পর্কে আরও তথ্যের জন্য, এই নিবন্ধের সাথে লিঙ্ক করা প্রকৃতি গবেষণা প্রতিবেদন বিমূর্ত দেখুন।
এই গবেষণায় প্রাপ্ত ভর স্পেকট্রোমেট্রি ডেটা ডেটাসেট ID PXD034811 (PDPL-MS ডেটাসেট) এর অধীনে iProX57 অংশীদার সংগ্রহস্থলের মাধ্যমে ProteomeXchange কনসোর্টিয়ামে জমা দেওয়া হয়েছিল।কাঁচা তথ্য কাঁচা ডেটা ফাইল আকারে প্রদান করা হয়.এই নিবন্ধটি মূল তথ্য প্রদান করে।
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. আশেপাশের সম্পর্কে জানা: প্রোটিন কমপ্লেক্স এবং ম্যাপ অর্গানেলগুলিকে চিহ্নিত করতে প্রক্সিমিটি-নির্ভর বায়োটিনিলেশন ব্যবহার করে। Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. আশেপাশের সম্পর্কে জানা: প্রোটিন কমপ্লেক্স এবং ম্যাপ অর্গানেলগুলিকে চিহ্নিত করতে প্রক্সিমিটি-নির্ভর বায়োটিনিলেশন ব্যবহার করে।Gingras, AS, Abe, KT এবং Raut, B. পারিপার্শ্বিকতার সাথে পরিচিতি: প্রোটিন কমপ্লেক্স এবং ম্যাপ অর্গানেলগুলিকে চিহ্নিত করতে প্রক্সিমিটি-নির্ভর বায়োটিনিলেশন ব্যবহার করে। Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. প্রতিবেশীকে বোঝা: জৈবিক জীবনের উপর প্রতিবেশীর নির্ভরতা ব্যবহার করুন।Gingras, AS, Abe, KT এবং Raut, B. প্রক্সিমিটি বোঝা: প্রোটিন কমপ্লেক্সের বৈশিষ্ট্য এবং প্রক্সিমিটি-নির্ভর বায়োটিনিলেশন ব্যবহার করে অর্গানেলের ম্যাপিং।কারেন্ট।আমার মতামত.রাসায়নিক।জীববিদ্যা 48, 44–54 (2019)।
গেরি, জেবি এট আল।ইমিউন কোষে ডেক্সটার শক্তি স্থানান্তর করে মাইক্রোএনভায়রনমেন্ট ম্যাপিং।বিজ্ঞান 367, 1091–1097 (2020)।
হার্টলিং, ইএল এট আল।দুই-প্রোটোম স্কেল নেটওয়ার্কগুলি মানুষের ইন্টারঅ্যাক্টোমের সেল-নির্দিষ্ট পুনর্নির্মাণ সনাক্ত করে।কক্ষ 184, 3022–3040.e3028 (2021)।